微刺激方案中成熟卵母细胞纺锤体参数与卵细胞质内单精子注射结局间的关系

黄 亚，吴鋆龙，徐 利，葛凤菊，陈亚宁，祁秀娟

（上海永远幸妇科医院生殖中心，上海 200131）

在人类体外受精-胚胎移植 （in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET）技术中，胚胎质量是影响临床妊娠结局的重要因素，如何选择最具发育潜能的胚胎用于移植，既能提高妊娠率，又能减少移植胚胎的数目，一直是生殖医学领域研究的方向。

成熟卵母细胞纺锤体出现在细胞减数分裂中期（metaphaseⅡ，MⅡ），为中间宽大逐渐向两边变窄的纺锤状细胞结构。MⅡ纺锤体靠近卵母细胞的外围，一端锚定于卵母细胞皮质区，基本与卵母细胞膜垂直[1]。由大量微管纵向排列而成的纺锤体具有双折射性，这是一种内部排列高度规律的生物大分子所具有的光学特性，当光进入纺锤体时，会折射成2 束互相垂直、传播速度不同的2 种偏振光，沿纺锤体短轴行进的偏振光速度较快，而沿长轴行进的速度较慢，从而造成光程差的改变，这种对光的阻滞作用称为纺锤体的阻滞性[2]。应用偏振光显微镜和Oosight Imaging 软件能够对纺锤体的阻滞性进行拍摄、测量，并通过特殊的算法对纺锤体照片进行定量分析，计算出光程差的变化量，即阻滞值（单位为nm）。已有研究表明，卵母细胞纺锤体的存在及阻滞值与卵细胞质内单精子注射 （intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）的结局有关[3]，阻滞值越大，提示纺锤体中的微管排列越有序，胚胎具有更好的发育潜能[4]。但以往各研究中促排卵方案不尽相同，卵子成熟度也不甚同步，造成数据与结论不一致[5-6]。本文回顾性分析在本院生殖中心采用克罗米芬加人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotropin,hMG）微刺激方案促排卵（该方案为我院的主流特色方案，其他中心只用于少数患者），并应用纺锤体观察仪观察行ICSI 助孕患者卵母细胞的纺锤体，探讨纺锤体是否可见以及阻滞值等参数与ICSI 结局间的关系，以期为临床预测优质胚胎、囊胚形成的概率及挑选胚胎移植提供参考依据。

资料与方法

一、资料

2017 年12 月至2019 年6 月间，收集在上海永远幸妇科医院生殖中心应用纺锤体观察仪观察卵母细胞纺锤体后而行ICSI 患者的临床资料。本研究获得上海永远幸妇科医院伦理委员会的批准。

二、方法

1.患者的纳入及分组： 根据ICSI 前能否观察到纺锤体分为可见纺锤体组（SP+）和未见纺锤体组（SP-）；再根据患者年龄分为＜35岁组、35～40岁组、≥40岁组3个亚组。排除输卵管积水、子宫内膜异位症、卵巢囊肿等可能影响卵子质量和受精结局的患者；排除经皮睾丸附睾穿刺取精行ICSI 的患者等；排除采用卵子激活后行ICSI 的患者以及取卵日确认为未成熟卵母细胞而进行体外培养成熟后行ICSI 的患者。

2.促排卵方案:采用克罗米芬加hMG 微刺激方案促排卵。患者于月经周期第3 日开始口服枸橼酸氯米酚 （高特制药有限公司）50 mg/d 至扳机前1 d；在月经周期第8 日开始给予肌肉注射尿促性素（hMG，丽珠医药集团股份有限公司）150 IU，隔天1 次。当主导卵泡直径≥18 mm 且每个卵泡平均血雌二醇水平≥200 pg/mL 时扳机，予皮下注射醋酸曲普瑞林（达必佳，辉凌制药公司）0.1 mg，扳机35 h 后取卵。

3.卵子和精子准备:经阴道B 超引导下取卵，对获取的成熟卵母细胞（MⅡ卵）培养2～3 h 后用透明质酸酶消化去除卵母细胞周围的颗粒细胞，待观察纺锤体和行ICSI。精液采用Pureception（SAGE，美国）密度梯度离心法处理，处理后置于室温，待行ICSI。

4.纺锤体的观察与ICSI 操作： 使用由特殊材料制成的ICSI 操作皿（NIPRO，日本）进行纺锤体观察。每个操作皿用预先平衡好的含50%血清替代品（serum protein substitute,SPS） hepes 缓冲的人输卵管液做3～5个小滴，将卵母细胞和精子加入不同的微滴中。使用Oosight 纺锤体成像系统（HAMILTON THORNE，美国）进行观察，首先在Live Video模式下选择液滴的空白区域扣除背景，然后在Live Oosight 模式下拍摄有纺锤体的卵母细胞图像，利用Oosight Meta 软件测量纺锤体长度、宽度及阻滞值、纺锤体与第一极体的角度。拍摄完成后，把纺锤体置于6 点钟或12 点钟位置进行常规ICSI 操作，操作后的卵子按顺序转入20 μL 卵裂液（SAGE，美国）微滴中，每滴一个卵子，即放置入37 ℃下5%CO2、5%O2、90%N2的三气培养箱 （KITAZATO，日本）中进行单胚胎培养。

5.评价指标

（1）受精判定：行ICSI 后16～20 h 观察受精情况，见双原核（2PN）为正常受精，单原核（1PN）或多原核（≥3PN）为异常受精。正常受精率=正常受精卵母细胞数/MⅡ卵数×100%；异常受精率=异常受精卵母细胞数/MⅡ卵数×100%。

（2）卵裂期胚胎评价：本中心结合2018 年《人类辅助生殖技术胚胎实验室数据质控专家共识》与本中心情况，将卵裂期胚胎质量分为5 级，见表1。本研究的优质胚胎（优胚）是指受精第2 天细胞数为3～5个或者第3 天细胞数为6～10个，并且胚胎级别为Ⅰ～Ⅱ级的胚胎，优先冷冻Ⅰ～Ⅱ级优胚，Ⅲ～Ⅳ级胚胎全部行囊胚培养，形成囊胚再冷冻，Ⅴ级胚胎直接废弃。卵裂率=卵裂胚胎数/正常受精卵母细胞数×100%；优胚率=优胚数/正常受精卵裂胚胎数×100%；囊胚形成率=囊胚形成数/囊胚培养数×100%。

6.冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer,FET）：全部采用激素替代周期准备内膜，从月经开始第10 天起采用B 超观察子宫内膜厚度及形态，当内膜厚度≥8 mm 时，解冻胚胎行单胚胎移植。移植后常规采用黄体支持。移植后第14 天检测血清β 人绒毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin β，β-HCG） 水平，β-HCG 阳性者判定为生化妊娠，2 周后行B 超检查，宫腔内见到孕囊或原始心管搏动者判定为临床妊娠。

7.统计学处理：应用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，呈正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较用t 检验；计数资料采用频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。不同年龄亚组间的比较采用one-way ANOVA 分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

一、患者及获卵情况

本组共纳入354例患者，平均年龄为 （37.4±5.3）岁，共获卵1 542 枚，其中MⅡ卵1 095 枚，可见纺锤体组（SP+）915 枚（83.56%），未见纺锤体组（SP-）180 枚（16.44%）。各年龄亚组患者的卵泡刺激素 （follicle-stimulating hormone，FSH） 水平差异显著，其中≥40岁组[（14.99±12.21） U/L]显著高于＜35岁组[（12.28±8.35） U/L]以及35～40岁组[（12.22±1.66）U/L]（P 分别为0.032、0.019）。3个年龄亚组间的抗米勒激素（anti-Müllerian hormone，AMH）差异显著，随着年龄的增高而下降[（2.09±2.02） U/L 比（1.34±1.66） U/L 比（0.78±0.87） U/L]（P 均＜0.001）。随年龄增高，各年龄组的人均获MⅡ卵数有逐渐降低的趋势，但差异尚无统计学意义（P=0.189），而人均获SP+卵数显著降低，随年龄组由小到大依次为（3.30±2.22）个、（2.91±2.10）个和（2.46±1.99）个（P=0.025）。患者其他一般情况及激素水平见表2。

二、有无可见纺锤体与ICSI 结局间的关系（见表3）

SP+组的正常受精率、卵裂率、优胚率、囊胚形成率及临床妊娠率均显著高于SP-组，差异均有统计学意义 （P＜0.05），SP+组异常受精率则低于SP-组（P＜0.000 1）（见表3）。

三、纺锤体的阻滞值等参数与ICSI 结局间的关系

在SP+组中，根据纺锤体阻滞值、体积、面积以及纺锤体与第一极体的角度共4个参数进行比较，只有纺锤体阻滞值在正常受精组与异常受精组、卵裂组与未卵裂组、优胚组与非优胚组、囊胚形成组与囊胚未形成组、临床妊娠组与临床未妊娠组之间的差异均有统计学意义，其他几个参数在上述4 组中差异均没有统计学意义（见表4）。

表1 卵裂期胚胎质量评价体系

表2 各年龄亚组患者激素水平与获卵情况

表3 有无可见纺锤体的ICSI 结局比较（%）

表4 纺锤体阻滞值等参数与胚胎发育结局间的关系

四、患者年龄与纺锤体阻滞值的关系

统计不同年龄组纺锤体阻滞值可以看出，随着年龄的增长，3 组的纺锤体阻滞值逐渐降低[分别为（2.1±0.6） nm、（2.0±0.6） nm 和（1.9±0.5） nm]，＜35岁组的纺锤体阻滞值显著高于其他2 组，差异有统计学意义（P=0.02 和P＜0.001），35～40岁组与≥40岁组间差异没有统计学意义（P=0.098）（见表5）。

表5 不同年龄组纺锤体的阻滞值

讨论

一、影响纺锤体可见的因素

人卵母细胞的纺锤体是桶状或纺锤状的细胞结构，分别出现于卵母细胞第一次减数分裂中期（MⅠ）和第二期减数分裂中期（MⅡ）。纺锤体通过微丝与染色体相互作用，在不同时期引导染色体的排列、运动和分离。以往研究提示可观察到纺锤体的百分比差异较大，Wang 等[7]在研究中观察到纺锤体的卵母细胞百分比为61.4%，而在García-Oro等[2]的研究中这一百分比为80.5%，造成这种差异的原因除了患者群体和促排卵方案的不同之外，还可能是由于人卵母细胞的纺锤体比较脆弱，容易受到外界环境的影响（如温度和pH 的波动），造成了微管的解聚[7]。Madaschi 等[8]仅在65.9%的卵母细胞中观察到了纺锤体，也可能是由于观察仪器的不同或者观察时间点不同。本研究由于观察的都是成熟卵母细胞，因此有83.56%的卵母细胞都观察到了纺锤体。随着年龄增长，卵巢功能逐渐衰退，本研究中3个年龄亚组的人均获卵数以及人均可见纺锤体MⅡ卵数也随之降低。

二、纺锤体可见与否及阻滞值等参数与胚胎发育、妊娠结局间的关系

在第二次减数分裂过程中，纺锤体通过微管与染色体结合，引导姐妹染色单体发生有序分离。纺锤体异常往往导致受精失败或异常、胚胎染色体异常、胚胎死亡、自然流产和遗传性疾病的发生[7]。本研究中未见纺锤体的MⅡ卵异常受精率显著高于可见纺锤体的MⅡ卵，说明纺锤体的缺失可能会造成染色体的分离失败，从而导致原核形成异常。朱亮等[9]的研究也证实了纺锤体对于胚胎早期卵裂（ICSI 后25～27 h）的发生起到显著的作用。有文献报道，可见纺锤体的MⅡ卵与未见纺锤体的MⅡ卵在几个重要的实验室质控数据（受精率、正常受精率、异常受精率、卵裂率等）上都有明显的差异[2,8,10]。本研究得出相同结论，而且本研究发现有纺锤体的MⅡ卵行ICSI 受精后囊胚形成率及临床妊娠率更高，即有更好的临床结局。

纺锤体的结构异常会导致非整倍体卵子和胚胎，对ICSI 后胚胎发育的妊娠结局有不利影响[1]。已有研究对阻滞值与原核评分[11]、胚胎评级[12]和囊胚形成[13]之间进行分析，结果表明较高的阻滞值提示组成纺锤体的微管具有更高的密度和更有序的排列，预示胚胎可能有更好的发育潜能，其结局会更好。在García-Oro 等[6]最近的荟萃分析中表明阻滞值可作为评判纺锤体结构的标准，其大小与妊娠率和活产率的高低都存在的显著的关系。Tomari等[14]的研究指出，卵母细胞纺锤体阻滞值高者较该值低者有更好的正常受精率、优胚率、囊胚形成率以及后续的临床妊娠率，但卵裂率无差异。本研究中正常受精组、卵裂组、优胚组、囊胚形成组以及临床妊娠组的阻滞值均显著高于异常受精组、未卵裂组、非优胚组、囊胚未形成组及临床未妊娠组，与前人的研究结论基本一致。同时,本研究测量了纺锤体的长和宽，计算纺锤体的体积、面积，但没有发现这2个指标在各组间存在差异。另一方面，2013 年Korkmaz 等[5]发表的研究中对于纺锤体预测着床率有不确定的看法，这可能是由于各生殖中心胚胎评级标准不尽相同，而且影响着床率的因素有多个，因此该结果仍需更大的样本量加以分析，可进一步结合囊胚培养及移植后的临床结果，从而得出更为准确的判定。

近年来，随着社会的发展和医疗水平的提高，女性的生育观念发生变化，生育年龄也在不断提高,同时“全面二胎”政策的开放，高龄妇女的再生育问题也给辅助生殖技术提出了更大的挑战。高龄是导致人工助孕失败的重要因素之一，关于纺锤体阻滞值研究的2 篇文献都指出[11-12]，随着年龄的增长，纺锤体阻滞值出现下降的趋势。本研究也有相同的结果，尤其是40岁以上妇女卵母细胞的纺锤体阻滞值与35岁以下者相比，有显著下降。因此，评估纺锤体阻滞值，选择纺锤体可见而且阻滞值高的胚胎或者囊胚进行移植，胚胎发育潜能更好，而患者越年轻对提高成功率越有帮助。

综上所述，纺锤体的缺失常常会意味着受精异常的风险,随着年龄的增高，纺锤体的阻滞值逐渐降低。在行ICSI 前，胚胎学家应观测纺锤体是否存在，把纺锤体放在6 点或12 点的位置行ICSI 而不是传统的以第一极体为基准，从而可提高正常受精率和卵裂率，尽量降低异常受精的概率，增加有效胚胎的数量，优选阻滞值高的卵子发育成的优胚进行移植，以提高临床妊娠率。但本研究中样本量不是足够大，尤其是阴性结果的样本偏少，还应纳入更多的样本，随访更多样本的移植结局（着床率和活产率）综合分析，从而更准确地评估阻滞值对优胚和囊胚形成以及对移植结局的预测价值。