葫芦巴种子提取物对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响*

(漯河医学高等专科学校药学系,河南漯河 462006)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，已经成为女性健康的最大威胁。常规化疗药物的毒副作用和多药耐药性是成为化疗失败的主要原因。中草药提取物在治疗肺癌及减毒增效方面发展迅速，在治疗肺癌方面有着巨大潜力。葫芦巴为豆科葫芦巴属植物，是世界上最早的药用植物之一。目前对葫芦巴的研究已经表明其具有抗氧化[1]、抗糖尿病[2]、降胆固醇[3]、抗生育[4]、抗免疫、抗肿瘤[5]等作用。本实验报道葫芦巴种子醇提取物对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。

1 材料

1.1 细胞

人乳腺癌MCF-7细胞株，购于广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2 药物与试剂

葫芦巴（Trigonella foenum-graecum L.）购买于国药控股漯河有限公司，经鉴定为豆科植物蒙古葫芦巴的干燥根。MTT、碧云天TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购于郑州天驰生物有限公司。

2 实验方法

2.1 药物制备

取干燥的葫芦巴药材100g，粉碎至适宜粒度，用1000mL75%乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味，加水分散至100mL制成水混悬液。分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分取有机层，得到4个部分：Ⅰ（石油醚层）、Ⅱ（乙酸乙酯层）、Ⅲ（正丁醇层）、Ⅳ（水层部分）。将提取的各个部分分别减压回收溶剂至干，加适量95%乙醇溶解，再加蒸馏水稀释(乙醇终浓度≤1.5%）制成实验所需浓度的混悬液。

2.2 细胞培养

将乳腺癌MCF-7细胞置于恒温培养箱中（CO2浓度：5%，T：37℃），用RMPI 1640完全培养液（含10%胎牛血清和1%双抗）培养，每天换液一次，换液前观察细胞生长情况，平均2天传代一次（观察细胞贴壁生长至培养瓶的80%-90%左右即可传代）。传代方法：除去培养瓶中的培养液，用PBS液冲洗2-3遍后加入0.25%胰蛋白酶0.8ml，消化3-4分钟，待消化完全后（细胞间隙变大，形状变圆即为消化完全），立即加入RMPI164培养液终止消化，轻柔吹打贴壁细胞使其充分脱落后分装，放入恒温培养箱中继续培养。

2.3 MTT检测法

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，细胞培养版96孔板每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至10000孔，边缘孔用无菌PBS填充；5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物；5%CO2，37℃孵育48小时；每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。上述实验重复3次。计算公式：细胞生长抑制率(%)=[1-(实验孔A值-对照孔A值)／对照孔A值]×100%。

2.4 TUNEL实验

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，细胞培养板6孔板每孔加入2ml，铺板使待测细胞调密度至1.6×106/孔。5%CO2，37℃孵育，待细胞贴壁。加入正丁醇层萃取物，孵育48H。PBS洗涤1次，用4%多聚甲醛固定60分钟；PBS洗涤1次，加入免疫染色洗涤液，冰浴孵育2分钟，再用甲醇配制的0.3%过氧化氢溶液中室温孵育20分钟，PBS洗涤1次；配制生物素标记液，在样品上加50μl生物素标记液，37℃孵育60分钟，PBS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10分钟。显色，荧光显微镜下观测。每个实验组检测200个细胞来判断细胞凋亡情况。

2.5 统计学处理

应用SPSS 17.0统计处理软件进行统计分析，结果以x±s表示，采用方差分析和t检验进行比较。P＜0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 MTT法检测葫芦巴提取物对MCF-7的抑制作用

利用MTT法检测葫芦巴醇提物各层萃取物高（100μg/ml）、中（10μg/ml）、低（1μg/ml）三个浓度分别对MCF-7细胞的抑制作用。各层萃取物低中浓度对MCF-7细胞的抑制作用较弱，高浓度萃取物对MCF-7有一定的抑制作用，其中正丁醇层萃取物抑制作用最强。

结果如表1所示。

表1 葫芦巴提取物对MCF-7细胞的抑制作用

3.2 MTT法检测正丁醇层萃取物对MCF-7细胞的抑制作用

利用MTT法检测正丁醇层萃取物1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的抑制率。正丁醇萃取物对MCF-7细胞的作用呈剂量依赖性，利用SPSS17.0计算得出IC50为81.30μg/ml，结果如图1所示。

3.3 TUNEL法检测正丁醇萃取物对MCF-7细胞凋亡的影响

利用TUNEL法检测正丁醇萃取物对MCF-7细胞凋亡的影响，实验组细胞加入正丁醇层萃取物，终浓度为81.30μg/ml，孵育48h。与对照组相比较，实验组凋亡率增加64.12%，结果如图2、3所示。

4 讨论

本研究利用MTT实验及TUNEL实验验证了葫芦巴种子醇提物正丁醇层萃取物对乳腺癌细胞MCF-7抑制及凋亡的影响。Mai等人研究证明葫芦巴种子油对Vero、WISH、MCF-7、HEp2四种细胞均有抑制作用，其中对MCF-7和HEp2两种细胞的作用最强[6]。Amr等人研究证明葫芦巴提取物对有DMBA诱导Wistar大鼠乳腺癌肿瘤有抑制作用[7]。我们首先利用MTT检测了葫芦巴种子醇提物各层萃取物作用48h对MCF-7细胞的抑制作用，高浓度的各层萃取物对MCF-7细胞均有抑制作用，其中正丁醇萃取物的抑制作用最强。然后我们又单独检测了正丁醇萃取物对MCF-7的作用，结果显示正丁醇萃取物对MCF-7的作用呈现剂量依赖性。为进一步验证正丁醇萃取物对MCF-7细胞的抑制作用是由提取物诱导所引起的，我们又利用TUNEL实验检测了在正丁醇萃取物IC50（81.30μg/ml）作用48h后的凋亡作用，结果显示，实验组凋亡率比对照组增加64.12%，验证了正丁醇萃取物能够诱导MCF-7细胞凋亡。Rahmati等人研究证明，从葫芦巴种子提取出的薯蓣皂苷元对肺癌细胞A549有抑制作用[8]。另有文献报道葫芦巴种子所含的番木瓜碱对淋巴样白血病有显著的活性，对小鼠肝癌(HAc)有明显的抑制作用[9]。葫芦巴提取物不同成分对癌细胞的作用不同，因此我们将进一步探索葫芦巴种子提取物对乳腺癌作用的具体成分。

综上所述，葫芦巴种子醇提物正丁醇萃取物诱导MCF-7细胞的凋亡。