不同分子质量牛骨胶原多肽制备复合膜特性研究

姚玉梅 袁湘汝 韩鲁佳 杨增玲 刘 贤

(中国农业大学工学院， 北京 100083)

0 引言

目前，资源短缺和白色污染问题日益加剧[1]，基于天然高分子原料开发生物基复合材料已成为高分子科学和材料科学的前沿领域之一。作为农产品加工业副产品的高附加值产品，基于动物骨资源酶解制备的胶原多肽(Collagen polypeptide, CP)因其优异的无毒性、低刺激性、热塑性、可降解性和独特的生物功能活性[2]，而成为一种具有广泛应用前景、环境友好型可再生高分子材料[3]。胶原多肽材料具有良好的生物相容性和可调控的降解性，在复合膜[4]、粘结剂[5]、表面活性剂[6]和生物医用材料[7]等领域具有广阔的应用前景，是开发绿色可再生资源的有效策略[8]。但是，单一胶原多肽材料脆性大、硬度高、亲水性强、力学性能差，不能满足实际应用的条件[9]。羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose, CMC)是纤维素最重要的衍生物之一，具有良好的保水性、分散稳定性和成膜性[10]，能够通过改性引入新的基团或化合物来增添一些新的性能[11]，常作为生物质基质和生物制品载体使用。

复合材料的综合性能受所用原材料的自身性能与改性作用的影响显著[12]。有研究者考察了胶原多肽与羧甲基纤维素共混对复合膜性能的影响，结果表明，与单一胶原多肽的材料性能相比，经羧甲基纤维素改性后制备的复合材料具有更为优异的理化性能，其热稳定性、机械强度、疏水性和延展性均明显提高[13-14]，并可兼顾抗氧化性、抗菌性、止血性等其他特性[11, 15]。此外，胶原多肽的浓度、颗粒尺寸、分子质量及生物功能活性也会影响复合材料的综合性能[16]。然而，胶原多肽作为胶原蛋白的水解产物，在实际生产中常因水解度低、水解不彻底等原因[17]，而导致其分子质量较大、分布较宽，使得材料性能不易控制。目前，胶原多肽的分子质量对复合膜材料性能影响的相关研究较少，且未见对其影响机理的探讨。

力学性能与疏水性是反映复合膜综合利用价值的评价指标，生物相容性是评估材料稳定性与可靠性的必要条件，两者都将决定材料最终能否应用于实际。为探讨胶原多肽的分子质量对胶原多肽-羧甲基纤维素(CP-CMC)复合膜力学性能的影响，本文以溶液流延法制备4种不同胶原多肽分子质量的CP-CMC复合膜，并分别测定复合膜的力学性能、理化性质和结构性能，探讨分子质量对复合材料的影响机理，以期为后续动物骨资源的高值化转化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

实验材料：牛骨胶原多肽1(CP1)由赛森化工产品有限公司提供，平均分子质量为700 u；牛骨胶原多肽2(CP2)由北京凯泰新世纪生物技术有限公司提供，平均分子质量为1 000 u；牛骨胶原多肽3(CP3)由北京盛美诺生物技术有限公司提供，平均分子质量为3 000 u；牛骨明胶4(CP4)由赛森化工产品有限公司提供，平均分子质量为20 000 u。羧甲基纤维素(99%，分析纯，山东西亚化工科技有限公司)，甘油(99%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

实验设备：RW20数显型电动搅拌器(德国IKA公司)；SevenEasy实验室pH计、XS105型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；PHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；Se-KTQ-150A型可调制膜器(沈阳科晶自动化设备有限公司)；TCYQ型水浴恒温振荡器(苏州市培英实验设备有限公司)；3367型双立柱台式电子万能材料试验机(美国Instron公司)；OCA21型接触角测量仪(德国Dataphysics公司)；SU3500型扫描电子显微镜(天美有限公司)；Spectrum400型傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司)；D8 Advance 型X射线衍射仪(德国Bruker公司)；SDT Q 600型热重分析仪(美国TA公司)。

1.2 CP-CMC复合膜的制备

CP-CMC复合膜的制备流程是对溶液流延法[18]加以改进。首先，将羧甲基纤维素溶解于蒸馏水中，在室温(20℃)下用搅拌器快速(600 r/min)搅拌至完全溶解，配置成质量分数为8%的CMC水溶液(溶液A)；其次，将不同分子质量的牛骨胶原多肽/明胶溶解于蒸馏水中，用2.0 mol/L的NaOH溶液将其pH值调节至10.0，在80℃下将其连续搅拌1 h制备8%的水溶液(溶液B1、B2、B3、B4)；再次，将溶液A和B按1∶1的质量比混合，以甘油作为增塑剂，添加量为成膜液的3%，充分搅拌混合溶液使其糊化成为均匀的成膜液；最后，在0.09 MPa真空度下脱气20 min后，称取相同质量的成膜液在聚四氟乙烯板上流延，并使用可调制膜器调节复合膜的初始厚度，然后将聚四氟乙烯板在干燥箱中50℃条件下干燥6 h拿出，于室温下放置24 h，将干燥的薄膜完整地剥离，编号为M1、M2、M3、M4(对应溶液B1、B2、B3、B4)。在不添加胶原多肽类物质条件下，以相同制备工艺制备单一CMC薄膜样品作为对照组样品M0。

1.3 CP-CMC复合膜理化性质

1.3.1力学性能测试

将5种膜样品分别切割成宽25 mm、长80 mm的长条，于测试前分别在温度23℃、相对湿度(50±3)%下的恒温恒湿箱中调节2 d，并使用灵敏度为1 μm的千分尺测量膜样品的厚度d。利用标准方法使用ASTM D882-02型电子万能材料试验机测试膜样品拉伸强度，略有改动[19]。将膜样品两端固定于夹具上，夹持距离为45 mm，拉伸速率为5 mm/min，通过计算机软件从拉伸应力-应变图自动计算杨氏模量，每种类型的膜样品重复测量8次。拉伸强度计算公式为

(1)

式中LP——膜拉伸过程中的峰值强度，N

A——膜样品的断面面积，m2

在静态模式下测量膜样品的断裂强度[19]，每种类型的膜样品重复测量8次。断裂伸长率计算公式为

(2)

式中 ΔL——断裂时的长度增量，mm

L——试样原长，mm

1.3.2水溶性测定

参照文献[20]的方法测定膜样品的水溶性，略有改动。将膜样品切割成50 mm×50 mm的矩形片，并在60℃和0.01 MPa下干燥24 h后称量，作为样品的初始干质量W0。将每个膜样品浸入250 mL烧杯中的200 mL蒸馏水中，并放至(25±0.1)℃的水浴振荡器中振荡一段时间。6 h后将膜样品拿出，并于60℃和0.01 MPa下干燥24 h以确定最终干质量W1。由初始和最终干质量计算膜样品的水溶性指数S，公式为

(3)

1.3.3表面亲水性评价

为探究分子质量对膜样品疏水性的影响，采用接触角测量仪测定膜样品与水的静态接触角[18, 21]。其中，膜样品尺寸为2.0 cm×2.0 cm，在表面滴加2 μL蒸馏水，静止一段时间后拍照，观察其浸润情况。

1.4 CP-CMC复合膜表征分析

1.4.1微观结构(SEM)

采用扫描电子显微镜对膜样品的表面形态进行表征。测试条件：膜样品脱水后用离子溅射仪对其表面喷金制样，仪器的加速电压为15 kV，工作距离10 cm。

1.4.2傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

采用傅里叶变换红外光谱仪对5种成膜粉末样品及其膜样品进行官能团特征分析，参照文献[22]略有改动。本实验采用KBr压片法，即将光谱级KBr和待测样品分别经玛瑙研钵充分研磨后，以1∶100质量比混匀。称取150 mg混合试样在压片机压制压力40 MPa下保压1.5 min，制成透明薄片。检测时，红外分析扫描范围为400～4 000 cm-1，扫描次数为32次，分辨率为4 cm-1。

1.4.3X射线衍射(XRD)

采用X射线衍射仪分析膜样品的结晶度差异性。一般情况下，结晶度越高，熔点越高，韧性越差，透光性越差。具体参数设置如下[18]：在CuKα射线下，X光管电压40 kV，管电流40 mA，5°～60°范围内，步长为0.02°，扫描频率为2(°)/min，测定X射线衍射图谱，并利用软件MDI-Jade 5.0进行数据分析。

1.5 热稳定性实验

采用热重分析仪对5种成膜粉末样品及其膜样品进行热解特性实验，参照文献[23]略有改动。为保证样品均匀性，将待测样品经玛瑙研钵充分研磨。称取5～6 mg研磨样品于坩埚中，随后开始实验。使用条件及相关参数为：以氮气为载气，流速为100 mL/min；以10℃/min的升温速率升温到700℃。

1.6 数据处理

采用Origin 8.5制图。数据均采用SPSS V20.0软件进行单因素方差分析，采用LSD检验对数据进行显著性差异分析，在95%置信区间认为具有统计学意义(p<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 CP-CMC复合膜的力学性能

表1 列出了4种复合膜的力学性能数据。由表可知，对比对照组M0，CP的添加显著改变复合膜的综合机械性能，即除M4外，复合膜具有更高的拉伸强度、断裂强度和杨氏模量。进一步分析可知，随着CP分子质量的增加，复合膜的拉伸强度和杨氏模量呈显著降低趋势，断裂强度呈先降低后增加再降低的趋势，在分子质量为700 u时为最大值；而随着CP分子质量的增加，膜样品的断裂伸长率增加，当分子质量大于3 ku时，膜的断裂伸长率开始下降。分析M1～M4膜样品的力学性能数据与CP分子质量的关系可知，在分子质量为700 u时，复合膜的力学性能最佳，拉伸强度、断裂强度和杨氏模量分别较对照组提升2.39、2.55、10.11倍，断裂伸长率较对照组降低40%，随后在分子质量为1 000 u时，复合膜力学性能较好。这可能是由于较小的分子质量可以软化膜的刚性，增加膜的柔韧性，提高膜的拉伸强度、断裂强度和杨氏模量[24-25]；分子质量较高的CP与CMC的相容性较差，影响膜样品的力学性能[18]。

表1 CP分子质量对CP-CMC复合膜力学性能的影响Tab.1 Effects of molecular weight distribution of CP on mechanical properties of CP-CMC composite films

注：同列不同小写字母表示组间差异显著(p<0.05)。

2.2 CP-CMC复合膜的结构性能

2.2.1相容性

在图1 (2θ表示角度变化)可以看到，M0在2θ=20°时出现强衍射峰，是羧甲基纤维素的特征衍射峰[26]。由M1～M4的XRD谱图变化可知，随着CP分子质量的增加，衍射峰宽度逐渐变宽，强度逐渐减弱，并且衍射峰的位置发生移动，表明复合膜的结晶能力逐渐减弱。这主要是由于复合膜中各组分之间存在强烈的作用，反应所形成的交联网络结构限制了羧甲基纤维素分子链的活动性，破坏了其原有的晶体结构[27]。

图1 5种膜样品的XRD谱图Fig.1 XRD spectra of five kinds of film samples

图2是粉末原料与复合膜样品的热重分析结果。如图2a、2b所示，所有成膜原料在升温开始阶段50～150℃范围有一个很小的失重峰，这明显是样品中水分的蒸发过程；150～350℃范围样品的失重速率明显提高，并达到峰值。其中，CMC在280℃发生明显失重，失重率为21.33%，这是由于羧甲基纤维素开始降解，—COO—氧化释放出CO2，从而质量迅速下降[18]。不同分子质量CP的失重曲线相差不大，均在290℃发生明显失重，其中CP1的失重率最高，为29.04%。由图2c、2d可知，对比单一CMC薄膜样品的TGA曲线，添加不同分子质量的CP后，复合膜样品失重范围大致类似，膜样品的失重率降低，且最大的降解温度向右偏移。其中，CP2对降低复合膜的最终失重率和提高最大失重速率的峰温具有明显作用。以上数据说明，复合膜的热稳定性有了较大的提升，这是由于CP与CMC的相容作用改善了膜样品的结构，造成了热解温度的变化。由图2还可以看出，相对于其它复合膜样品而言，M0膜样品前期水分的蒸发失重多，说明单一CMC薄膜样品具有较强的吸水性。

图2 5种成膜原料及其膜样品热解特性的热重分析Fig.2 Pyrolysis characteristics of five kinds of film forming materials and their film samples using thermogravimetric analysis

2.2.2傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

图3 5种成膜原料及其膜样品的FT-IR图Fig.3 FT-IR spectroscopy of five kinds of film forming materials and their film samples

2.2.3微观结构(SEM)

图4 5种膜样品的扫描电镜图Fig.4 SEM images of five kinds of film samples

图4是单一CMC薄膜样品与4种CP-CMC复合膜样品的表面微观结构图。在500倍扫描电镜下，图4a 显示单一CMC薄膜样品表面存在少许沟槽、褶皱，圆形或椭圆形CMC疏松堆积排列(图4b)，这样的材料结构单一且不稳定，严重影响薄膜的力学性能与疏水性；图4c～4f分别显示添加了不用分子质量CP制备的复合膜表面明显变得光滑、致密和连续，说明CP与CMC在溶液中具有较好的相容性，对膜结构的影响较大。结合5种膜样品的力学性能、相容性和FT-IR等结果，说明CMC与CP的结合将会改变膜样品的表面微观形态，提高复合膜的相关机械强度，改善结晶度，并使得结构更加均匀，尺寸稳定性增加[24]。随着添加CP分子质量的增加，复合膜样品的表面越来越粗糙(图4c～4f)，这是因为较高分子质量的CP为固体结晶状，易导致成膜后少量析出[18]。此外，明胶-羧甲基纤维素复合膜样品的微观结构中存在较多气泡(图4f)，这是由于明胶的分子质量较大，仍保存部分蛋白质的特性，具有优异的起泡性和泡沫稳定性。

2.3 CP-CMC复合膜的疏水性

图5 5种膜样品的静滴接触角Fig.5 Contact angle determination of five kinds of film samples

水溶性和表面亲水性通常由分子结构决定，包括结晶度和交联，是膜样品热稳定性、微观形态和疏水性的反映。一般来说，水溶性越小，表观接触角越大，表面越疏水[21, 31]。对照组样品的水溶性指数为63.55%，而复合膜M1～M4的水溶性指数分别为41.00%、34.91%、41.32%、40.16%。CP的添加使得复合膜样品的水溶性显著降低，且复合膜的水溶性随CP分子质量的增加呈先降低后增加趋势，且M2膜的水溶性最低。结合SEM 的结果分析可知：随着复合膜样品结构密度的增加，疏水性逐渐增加。由图5可知，对照组样品的接触角为33.94°，而复合膜M1～M4的接触角分别为45.77°、50.06°、30.93°、82.91°；随着CP分子质量的增加，接触角呈先增大后减小再增大的趋势，这说明CMC与CP共混在一定程度上可以提升膜样品表面的疏水性。相较于对照组，在CP分子质量为1 000 u时，复合膜的水溶性指数降低了28.64个百分点，即降低了45%，接触角提高了16.12°，充分表明低分子质量的CP有利于改善复合膜样品的疏水性。这是由于CP分子质量的变化会引起其表面疏水性、溶解度等性能的变化[32]。此外，复合膜M4的接触角最好，且吸水溶胀程度大，这是由于明胶保留了蛋白质的部分特性，使得复合膜样品表面具有一定的疏水性，可作为一种发泡剂应用。

3 结束语

以4种不同分子质量的胶原多肽为研究对象，制备了4种复合膜样品，并对获得的膜样品进行了微结构与性能分析。研究发现，添加胶原多肽/明胶可以明显改善膜样品的力学性能、疏水性、相容性和表面微观结构。在胶原多肽分子质量为700～1 000 u时，复合膜具有更高的拉伸强度和更低的断裂伸长率，热稳定性和疏水性最高，即最高降解温度由280℃升至290℃；在分子质量为1 000 u时，水溶性指数降低45%，接触角提高16.12°；随着胶原多肽分子质量的增加，复合膜的力学性能降低，表面微观结构粗糙，并出现较多气泡，疏水性降低。研究结果表明，胶原多肽的分子质量对其复合膜材料具有显著影响，且700～1 000 u为胶原多肽向复合膜材料转化的最佳分子质量区间。