雷公藤甲素介导线粒体凋亡途径抗肿瘤研究进展

李建民，刘江，吴发印

(遵义医科大学第五附属(珠海)医院口腔颌面外科，广东 珠海 519100)

雷公藤甲素(triptolide，TP)又称雷公藤内酯醇，是从卫矛科雷公藤属植物雷公藤中提取鉴定出来的一种化合物，分子式为C20H24O6，水溶性较差。雷公藤广泛生长于我国南部和东南部山区，在传统中医用药中具有悠久历史。雷公藤组成成分复杂，而环氧化二萜类化合物TP是目前众多单体中研究最多的一种，相关分子机制也较为成熟[1]。TP在自身免疫系统疾病(如类风湿关节炎[2]、系统性红斑狼疮[3])中疗效确切，临床上常用的雷公藤片、雷公藤多苷片均含有TP活性成分。近年来，TP在抗肿瘤方面的作用逐渐成为研究热点。

线粒体是真核细胞ATP代谢的主要场所，除为细胞生长、增殖、分化等生物学行为供能外，还广泛参与了细胞凋亡、肿瘤耐药的发生发展[4]，一旦线粒体功能出现紊乱可快速导致细胞凋亡。在TP缺乏明确的抗肿瘤机制及效应靶点的背景下，现就近年来TP通过线粒体途径调控肿瘤细胞凋亡的机制予以综述。

1 线粒体凋亡通路

细胞凋亡是细胞程序性死亡的主动过程，细胞凋亡分为内源性凋亡和外源性凋亡，而线粒体凋亡通路是细胞内源性凋亡的主要调节通路[5]。线粒体凋亡通路以外膜通透性增加、细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)释放为主要调节步骤。当细胞接收到凋亡刺激信号时，线粒体外膜通透性升高，线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)开放，位于线粒体内膜上的Cyt C释放入胞质，与凋亡蛋白酶刺激因子相互作用，引发胱天蛋白酶(caspase)9活化，从而开启级联反应，激活下游caspase-3、6等凋亡执行蛋白[6]，引起细胞不可逆性凋亡。除Cyt C外，线粒体外膜还可释放其他促凋亡相关因子[7]。

2 TP介导线粒体凋亡通路

2.1促进线粒体凋亡相关因子表达

2.1.1p53 p53是常见的抑癌基因之一，其表达失衡常导致肿瘤的发生、转移。p53在调节细胞凋亡、细胞周期及细胞衰老中起核心作用。当细胞处于DNA断裂、癌基因激活或缺氧等不利条件下时，p53蛋白反应性表达，促进细胞凋亡。p53的低水平或基础水平有利于维持线粒体功能的稳定。细胞内氧自由基的清除需要超氧化物歧化酶的作用，后者能有效维持线粒体内的氧化平衡。p53突变型细胞中锰超氧化物歧化酶的表达增加，其加强了线粒体膜电子链复合物的电子传递，导致线粒体呼吸作用增强，阻断因活性氧类(reactive oxygen species，ROS)蓄积引起的细胞凋亡[8]。p53可直接影响线粒体外膜的通透性，释放促凋亡因子，介导细胞凋亡[9]。研究证实，TP具有激活肝癌细胞p53的能力[10]，并促进p53从细胞核转位至线粒体，从而反式激活B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族基因，导致线粒体外膜通透性增加。相反，使用p53拮抗剂可抵消TP诱导的p53过表达和Bcl-2家族基因转录，从而维持线粒体膜通透性，阻止细胞凋亡[11]。因为p53主要为核蛋白，依赖于一系列的化学修饰才可从细胞核转位至胞质发挥作用，而p53的核转位过程常依赖于鼠双微体2(murine double minute 2,MDM2)对p53的泛素化能力，高水平的MDM2抑制p53从细胞核向细胞质易位，促进相关p53复合物在细胞核内降解[12]。近年来有学者开始研究针对MDM2的靶向治疗药物，试图阻断MDM2与p53的相互作用[13]。免疫组织化学研究显示，胃癌组织中的MDM2相较于正常组织、慢性胃炎组织及肠上皮化生组织处于高表达水平[14]；体外研究发现，TP能显著抑制MDM2蛋白的表达，增加p53、caspase-3、caspase-9的表达，促进AGS胃癌细胞凋亡，且不依赖p53途径，该结果与TP介导的MDM2/蛋白激酶B途径相关[15]。

2.1.2Bcl-2家族 Bcl-2家族在调节线粒体功能和外膜通透性上发挥核心作用，控制着促凋亡因子的释放[16]。p53对线粒体膜通透性的改变依赖于与Bcl-2家族的交互作用。Bcl-2家族蛋白按功能可划分为抑凋亡蛋白亚家族和促凋亡蛋白亚家族，Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等属于抑凋亡蛋白亚家族，而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)Bcl-2同源拮抗剂(Bcl-2 homologous antagonist/killer,Bak)和Bok属于促凋亡蛋白亚家族，其中Bax/Bak是细胞凋亡内在途径的核心调节因子。凋亡刺激产生后，Bax/Bak被激活并从胞质转移到线粒体外膜处，线粒体外膜通透性改变，这一过程被视为Bcl-2家族调控线粒体凋亡的关键步骤[17]。目前发现Bax通过两种方式改变线粒体外膜通透性。Bax介导与组成mPTP的腺苷转位因子、电压依赖性阴离子通道结合，开放mPTP，释放促凋亡因子。由于Bcl-2、Bcl-xL与Bax/Bak互为拮抗，故抑凋亡蛋白亚家族Bcl-2、Bcl-xL可竞争性结合腺苷转位因子以阻止Bax的凋亡效应。Bax和Bak耦合的寡聚结构在介导线粒体外膜的激活中起至关重要的作用。活性Bax或Bak经过一系列构象变化后，形成的二聚体或更高级的低聚物可部分组成或完全组成线粒体外膜上的异质孔，这些膜孔的大小、寿命取决于Bax/Bak的密度[18]。此外，异质孔也能增加线粒体外膜的通透性[18]。TP具备上调Bcl-2家族促凋亡蛋白亚家族、下调抑凋亡蛋白亚家族的能力。Ni等[19]发现，TP可通过下调Bcl-2抑制人子宫内膜癌HEC-1B裸鼠移植瘤的生长。针对紫杉醇耐药型肺癌A459细胞的研究显示，TP介导糖原合成酶激酶-3β、Bax、caspases-3、 caspases-9的上调增加肿瘤敏感性，诱导细胞凋亡[20]。Ma等[21]的研究发现，TP可有效上调Bax，下调Bcl-2的表达，诱导胰腺癌细胞凋亡。体外研究发现，TP通过上调Bax，下调Bcl-2的表达介导线粒体途径，促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡[22]。

2.1.3Cyt C与casepase家族 正常状态下，Cyt C位于细胞线粒体的外膜内，主要参与呼吸作用、能量代谢，其可通过外膜进入胞质。当各种信号分子引起外膜通透性增加时，成熟的Cyt C受多层调控机制作用后进入胞质，引起caspase级联放大反应，参与细胞凋亡[23]。线粒体外膜通透性介导的凋亡依赖于caspase蛋白的活化[24]。caspase家族是一组特异性的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，广泛参与了真核细胞凋亡，负责线粒体凋亡途径的最后一环。当处于上游的启动者caspase-9接收信号激活后，通过异源活化可将凋亡信号放大，使处于下游的凋亡执行者caspase-3/7显著活化。活化的caspase可靶向切割细胞内诸多生物酶结构中的天冬氨酸残基肽键，使酶失活，引起细胞不可逆凋亡。研究发现，TP可使Cyt C的释放增加、活化caspase水平升高[25-26]。TP对低分化癌细胞有更强的杀伤力，用TP处理低分化胃腺癌细胞24 h后，caspase-3/7的表达量较中分化腺癌高约3倍[27]。

2.2抑制线粒体相关抗凋亡蛋白表达

2.2.1Sp1与热激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70) Sp1是一种核转录基因，参与部分生存必备基因的转录，其转录产物之一为HSP70。HSP70参与蛋白质的合成、修复，抑制细胞凋亡[28]。HSP70大量存在于肿瘤细胞的线粒体中，在大部分正常组织的线粒体中表达水平非常低[29]。一旦HSP70的表达出现抑制，将导致电子传输链组件中几种线粒体编码RNA的水平降低，肿瘤细胞内线粒体电子传递链配合物蛋白出现变性，膜电位丧失，耗氧率降低、ATP生成减少，引起细胞凋亡[30]。有研究表明，TP与光霉素(一种Sp1化学抑制剂)的作用效果类似，具备抑制Sp1，下调HSP70表达的能力[27]。当应用pCMV-Sp1(Sp1激动剂)后，胃癌细胞系Sp1的表达增加，抵消了TP的抗癌效应[27]，说明TP具有靶向抑制Sp1和HSP70的作用。HSP70在恶性肿瘤细胞中常呈高表达状态，尤其是在低分化细胞株中，且与肿瘤的耐药性呈正相关[31]。有学者认为，TP可作为HSP70的抑制剂，通过抑制HSP70增强胃癌耐药细胞系MKN5/AR对阿帕替尼(新型胃癌靶向药物)的敏感性[32]。单独应用阿帕替尼时，与MKN5(敏感系)相比，MKN5/AR(耐药系)细胞内的HSP70表达水平升高，对MKN5/AR细胞的半数抑制浓度为70.527 μmol/L；联用小剂量TP后，阿帕替尼对MKN5/AR细胞的半数抑制浓度为11.679 μmol/L，且低浓度的TP对细胞活性无影响[32]。以上研究证实，TP具备抑制HSP70、逆转癌细胞耐药、高效低毒的抗肿瘤活性。

2.2.2沉默信息调节因子3(silent information regulator 3,SIRT3) SIRT3是sirtuin家族成员之一，是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶，主要定位于线粒体，通过去乙酰化修饰反应底物(组蛋白、转录因子、代谢酶)，调控细胞的代谢、癌变、衰老、干细胞分化、上皮间-充质转化等细胞生理活动[33]，具备延长细胞寿命的功能。在线粒体中，SIRT3调节代谢、能量稳态和线粒体生物合成，通过去乙酰化作用增强脂肪酸β-氧化，导致乙酰辅酶A生成增多，促进三羧酸循环，增加ATP的生成[34]。研究发现，SIRT3可激活柠檬酸合酶，促进乙酰辅酶A进入三羧酸循环[35]。除增强能量代谢外，SIRT3还调控mPTP的关闭，维持线粒体外膜通透性，减少Cyt C、凋亡诱导因子释放到细胞质[36]。同时，SIRT3还可通过清除ROS、调控抗氧化酶的激活抑制肿瘤细胞凋亡，维护细胞免受氧化应激损伤[37]，抑制动力相关蛋白-1(dynamic-related protein 1,Drp1)向线粒体移位[38]，保护线粒体完整性，改善相关因子对线粒体损害作用。Yang等[39]的研究显示，SIRT3通过关闭mPTP，抑制TP依赖线粒体凋亡途径，挽救细胞。用TP处理p53缺陷的非小细胞肺癌细胞发现，TP能减弱线粒体SIRT3的表达，导致电子传递链配合物Ⅰ和Ⅱ(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶复合物和琥珀酸脱氢酶)高乙酰化，改变线粒体膜电位；过表达SIRT3能恢复线粒体功能，拮抗TP对细胞的凋亡作用[40]。但Kong等[41]的研究显示，TP介导非霍奇金淋巴瘤细胞的凋亡与TP上调SIRT3的表达有关。该研究发现，糖原合成酶激酶-3β被SIRT3介导的去乙酰化激活后，引起线粒体易位和Bax积累，并降低线粒体膜电位，从而诱导细胞凋亡。Kong等[41]认为，TP可能通过增加SIRT3的表达，激活SIRT3/糖原合成酶激酶-3β/Bax途径，触发非霍奇金淋巴瘤细胞中的线粒体凋亡途径。SIRT3可能在癌症的发生和发展中起双重作用[42]。也有学者认为，SIRT3在癌症中所起的作用取决于细胞环境[43]，如含高水平ROS的癌细胞具备更强的侵袭力和耐药性，此时SIRT3起降低ROS水平的作用，发挥抗癌效应；当ROS过量蓄积，产生氧化应激诱导细胞凋亡的环境下，SIRT3起维持ROS平衡，保护癌细胞的作用[44]。可见，TP可能具备在不同细胞环境中依赖线粒体途径发挥抗肿瘤的个性化能力。

2.3介导氧化应激及能量代谢失衡 氧化应激是细胞氧化还原的失衡状态，呈过氧化表现。当线粒体膜的完整性、跨膜电位、呼吸链等受干扰可引发ROS大量生成，引起氧化应激，损害细胞器，加速细胞凋亡[45]。ROS是氧化应激过程的核心，其能否被有效清除决定氧化应激是否发生。在部分肿瘤细胞中，线粒体呼吸作用相关基因的表达受到抑制，需要依赖糖酵解途径产生更多的ATP[46]。相较于正常细胞，癌细胞的糖酵解、氧化磷酸化反应增强，ROS减少，癌细胞的抗凋亡能力增强[47]。抑制糖酵解[48]和底物氧化磷酸化[49]过程可减少癌细胞能量的产生，这也是一种诱导肿瘤细胞凋亡的重要方法。氧化应激与能量代谢失衡密切相关，TP可降低还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶复合物和琥珀酸脱氢酶的活性，抑制氧化磷酸化过程，细胞内ROS的消耗减少，ROS蓄积，能量生成减少，从而诱导细胞凋亡[40]。Liu等[50]研究发现，TP可上调神经胶质瘤细胞内ROS的表达，阻断蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路。蛋白激酶B通过磷酸化糖原合成酶激酶-3β而抑制后者的活性，增强糖代谢反应。TP可通过抑制蛋白激酶B相关途径，抑制糖代谢，同时促进ROS产生，引起癌细胞氧化应激、能量失衡。Xi等[51]认为，TP可有效抑制细胞对葡萄糖的消耗，减少ATP生成。ATP的释能反应依赖于ATP酶的水解作用，研究证实，TP可阻止ATP酶与ATP结合，抑制ATP酶活性[52]。

2.4介导线粒体融合与分裂 线粒体结构的完整与稳定是保障其功能的根本。在正常细胞内，线粒体处于分裂与融合共存的动态平衡中，这一状态是线粒体实现功能的基础[53]。在哺乳动物中，线粒体的分裂与融合依靠线粒体融合蛋白(线粒体融合蛋白1和2)和线粒体分裂蛋白(Drp1)的作用。线粒体融合蛋白能融合线粒体内呈嵴形状的内膜，扩大膜面积，从而立体地增强线粒体氧化磷酸化功能；而线粒体分裂蛋白Drp1可聚集在线粒体外膜上，使线粒体外膜局部裂解，增加线粒体外膜通透性，使Ca2+外流，ROS蓄积，促进凋亡因子释放，导致细胞凋亡。研究表明，TP是依赖线粒体途径介导细胞凋亡的，给予TP后可以观察到线粒体变性、断裂、线粒体去极化、ROS过度生成、ATP生成减少[54-55]。这个过程与TP可靶向调节线粒体融合蛋白与分裂蛋白有关[56]。Hasnat等[54-55]研究发现，TP以Drp 1蛋白为靶点，促使Drp1从胞质转移至线粒体外膜上，引起Cyt C释放。Zhang等[57]发现，TP可调控小鼠睾丸细胞内线粒体融合蛋白2呈低表达状态。综上可知，TP可促进线粒体外膜分裂，抑制线粒体膜融合。

3 小 结

TP因具有明确、广泛的抗肿瘤活性而得到学者们的普遍认可。TP的抗肿瘤作用依赖于线粒体凋亡途径，其以线粒体为核心，升高线粒体外膜通透性为基点，相关因子为效应靶点，引起线粒体生物功能及结构紊乱，促进肿瘤细胞凋亡。TP介导的线粒体凋亡途径与凋亡相关因子变化、ROS蓄积、能量代谢紊乱、线粒体膜结构分裂等线粒体生物过程密不可分，最终引起线粒体膜通透性增加，Cyt C等促凋亡因子释放入细胞质，引起细胞不可逆性凋亡。未来需要进一步深入研究TP在线粒体凋亡途径上的作用靶点、基因转录以及修饰等，以期更加详尽地了解TP的抗肿瘤机制。