血清嗜酸粒细胞来源神经毒素与阳离子蛋白对儿童早期喘息性疾病再发喘息的预测价值

朱蕾，殷勇，赵丽霞，刘世英，王东

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心呼吸内科，上海200127)

喘息是儿童时期最常见的呼吸道症状之一，儿童喘息性疾病的表现形式多样，是一种异质性疾病。近年来喘息性疾病发生率在全球范围内呈明显上升趋势。国外资料显示，大约1/3的儿童在3岁前至少有过1次喘息[1]。大部分婴幼儿早期喘息发作是暂时的，随着肺部的发育和免疫功能的成熟，大部分婴幼儿喘息发作会完全缓解，据2000年中国城区儿童哮喘流行病学资料显示，70%的哮喘儿童喘息首发于婴幼儿期[2]。支气管哮喘(简称哮喘)是儿童时期最常见的慢性气道炎症性疾病，临床表现为反复的喘息、咳嗽、胸闷和气促。近年来哮喘的全球总体患病率呈上升趋势，哮喘患病率由1990年的1.00%上升到2000年的1.54%，到2010年上升到3.02%，2010年哮喘患儿的现患率、累计患病率与2000年相比分别增加了50.6%和53.3%[2-4]。大量研究表明，哮喘是嗜酸粒细胞(eosinophil,EOS)浸润为主，由免疫球蛋白(immunoglobulin E，IgE)介导，伴随气道高反应为特征的慢性气道炎症性疾病[5-7]。EOS的分泌活动主要是通过颗粒蛋白的释放，包括嗜酸粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein,ECP)、嗜酸粒细胞来源神经毒素(eosinophil-derived neurotoxin,EDN)、碱性蛋白和EOS过氧化物酶，这些蛋白可引起组织损伤和气道炎症的播散。研究表明，EDN和ECP几乎只由EOS所分泌[8]，因此EDN和ECP水平的任何变化可直接反映EOS的炎症反应。本研究试图探究早期喘息患儿血清EDN、ECP、IgE和EOS水平，探讨一种无创的气道炎症检测手段，对早期喘息婴幼儿进行评估，早期识别有发展为哮喘倾向的喘息患儿，以利于喘息患儿的早期干预和早期治疗。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年7月至2017年3月上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心呼吸科住院的60例早期喘息患儿，年龄3～12月龄，随访观察1年，根据出院1年后患儿是否再发喘息以及再发喘息的次数分为复发喘息组(32例)和非复发喘息组(28例)。其中复发喘息组男21例，女11例，年龄平均(4.4±2.2)个月；非复发喘息组男17例，女11例，年龄平均(5.6±2.9)个月。两组患儿性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。急性毛细支气管炎的诊断标准符合《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识(2014年版)》[9]。

1.2研究方法

1.2.1样本采集 无菌采集患儿外周静脉血3 mL，室温凝固30 min后，以离心半径15 cm,3 000 r/min离心15 min，仔细吸取血清至少500 μL,放置于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2血清EDN和ECP测定 采用酶联免疫吸附测定法分别检测血清EDN和ECP水平，见图1和图2。EDN试剂盒购自日本MBL公司，ECP试剂盒购自武汉华美公司，高速离心机(5810R型)购自美国Eppendorf公司，酶标仪(Multiskan FC型)购自美国Thermo公司，恒温箱(LRHS-300-II)购自上海跃进医疗器械厂。

1.2.3血清IgE和EOS测定 采用酶联免疫吸附测定法测定血清总IgE水平。采用美国Beckman Conlter公司自动检测机(EPICSXL型)对血细胞五分类计数，EOS计数正常值为(0.02～0.5)×109/L，EOS百分比正常值为0%～5%。

ECP：嗜酸粒细胞阳离子蛋白

EDN:嗜酸粒细胞来源神经毒素

2 结 果

2.1两组血清EDN、ECP、IgE、EOS计数比较 复发喘息组血清EDN、ECP、IgE水平高于非复发喘息组(P<0.05)，两组血清EOS计数比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2EDN预测再发喘息的ROC曲线 EDN预测喘息患儿是否再发喘息的ROC曲线下面积为 0.643,差异有统计学意义(P=0.047)，Youden指数最大值为0.276，其所对应的EDN最佳诊断界值为28.32 μg/L,灵敏度为56.2%，特异度为71.4%，见图3。

表1 两组早期喘息患儿血清EDN、ECP、IgE、EOS比较

EDN：嗜酸粒细胞来源神经毒素；ECP：嗜酸粒细胞阳离子蛋白；IgE:免疫球蛋白E；EOS：嗜酸粒细胞；a为t值，余为Z值

EDN：嗜酸粒细胞来源神经毒素；ROC：受试者工作特征曲线

2.3ECP预测再发喘息的ROC曲线 ECP预测喘息患儿是否再发喘息的ROC曲线下面积为0.656,差异有统计学意义(P=0.029)，Youden指数最大值为0.33，其所对应的ECP最佳诊断值为23.41 μg/L,灵敏度为43.7%，特异度为89.3%，见图4。

2.4IgE预测再发喘息的ROC曲线 IgE预测喘息患儿是否再发喘息的ROC曲线下面积为0.767,差异有统计学意义(P<0.001)，Youden指数最大值为0.495，其所对应的IgE最佳诊断值为19 kU/L,灵敏度为78.1%，特异度为71.4%，见图5。

2.5EDN、ECP、IgE三者ROC曲线下面积比较 ECP与EDN的ROC曲线下面积比较差异无统计意义(Z=0.127，P=0.899)，ECP与IgE的ROC曲线下面积比较差异无统计学意义(Z=1.231，P=0.218)，EDN与IgE的ROC曲线下面积比较差异无统计学意义(Z=1.363，P=0.173)。见图6。

ECP：嗜酸粒细胞阳离子蛋白；ROC：受试者工作特征曲线

IgE：免疫球蛋白E；ROC：受试者工作特征曲线

EDN：嗜酸粒细胞来源神经毒素；ECP：嗜酸粒细胞阳离子蛋白；IgE:免疫球蛋白E；ROC：受试者工作特征曲线

图6 EDN、ECP、IgE三者ROC曲线下面积比较

3 讨 论

婴幼儿喘息是儿科常见的一种临床症状，引起喘息的病因多种多样，发病机制也十分复杂。哮喘患儿往往在婴幼儿期即出现喘息症状，但大部分婴幼儿喘息并不会发展为哮喘。Saglani等[10]研究发现，10个月龄婴幼儿喘息患儿已经出现气道重塑及嗜酸粒细胞性气道炎症。哮喘是一种由多种因素引起的异质性疾病，目前对于哮喘的诊断仍比较困难。年长儿可通过肺功能检查进行确诊，而对于婴幼儿目前仍缺乏客观的实验室指标。哮喘是由多种细胞介导的气道慢性炎症性疾病，包括EOS、肥大细胞、T淋巴细胞、上皮细胞等，其中以EOS浸润为主要特征。EOS通过释放颗粒蛋白、白三烯等细胞因子引起气道上皮损伤，支气管收缩等导致气道高反应性、气道受损,从而引起临床的反复咳嗽、喘息、气促和胸闷等症状[11]。

Kim等[12]研究结果表明，与EOS计数相比，EOS的脱颗粒产物EDN和ECP更能准确地反映EOS的活动。本研究结果显示，复发喘息组和非复发喘息组EOS计数比较差异无统计学意义(P>0.05)，与上述研究结果相符，提示EOS计数在预测喘息患儿再发喘息方面可能不是一个很好的客观指标。Sedgwick等[13]研究发现，哮喘患者的EOS有更多的EDN，当EOS受到巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-5激活后，大量的EDN随着EOS的脱颗粒而释放，进而对气道造成严重的损伤。Snijders等[14]研究表明，EOS分泌的ECP可介导气道上皮和细胞破坏，诱导肥大细胞释放组胺等造成气道炎症，在EOS性炎症中起重要作用。

研究表明，ECP可作为EOS的活化标志物，ECP水平是客观反映气道炎症活动指标之一[15-17]。Boumendjel等[18]研究表明，血清ECP水平是一个很好的哮喘生物学标志物，动态监测ECP水平的变化可有助于判断呼吸道炎症的活动和严重程度、预测疾病的发作，以及评估治疗效果。本研究结果显示，复发喘息组患儿血清ECP水平高于非复发喘息组(P<0.05)。本研究ROC曲线得出，ECP对婴幼儿早期喘息再发喘息具有一定的预测价值，对应的灵敏度为43.7%，特异度为89.3%，与以往国内外的多数文献观点相符[19-22]。路明等[19]研究发现，哮喘组及喘息性支气管炎组患儿血清ECP水平均明显高于对照组，而哮喘组与喘息性支气管炎组患儿血清ECP水平差异无统计学意义。Miyoshi[20]检测了33例喘息婴儿血清ECP水平，并对33例患儿随访3个月，发现发展成哮喘患儿血清ECP水平明显增高，且最初血清ECP>20 μg/L的所有17例患儿均发展成了哮喘；Koller等[21]研究发现，首次喘息发作婴幼儿组血清ECP水平明显高于对照组，且随访1年后发现发展成哮喘的患儿最初血清ECP水平显著高于未发展成哮喘的患儿。陈运生等[22]检测了32例毛细支气管炎儿童急性期、缓解期及肺炎患儿血清ECP水平变化，结果表明急性期毛细支气管患儿血清ECP水平明显高于肺炎组，且缓解期水平较急性期明显下降。

本研究结果显示，复发喘息组患儿血清EDN水平明显高于非复发喘息组(P<0.05)。根据ROC曲线得出，EDN对于婴幼儿早期喘息再发喘息具有一定的预测价值，对应的灵敏度为56.2%，特异度为71.4%。有项研究纳入了150例年龄为6～24个月龄的急性呼吸道合胞病毒感染细支气管炎患儿，分为试验组(每晚服用4 mg孟鲁司特颗粒)和安慰剂组，主要终点指标为血清EDN水平和出院后12个月内再发喘息和喘息次数情况，结果表明，以53 μg/L为EDN升高的临界点，3个月血清EDN水平对12个月复发喘息次数的阳性预测值为57%，阴性预测值为76%，灵敏度为72%，特异度为62%，表明EDN水平是诊断和监测婴幼儿喘息的重要生物学标志物，此外，3个月时的高血清EDN水平可能是预测复发性喘息/哮喘发展的生物学标志物[23]。

流行病调查提示，哮喘病例中约50%伴有过敏[24]。Sherrill等[25]研究表明，儿童早期的过敏状态是以后发展为喘息症状的主要危险因素。有研究表明，早期对吸入性变应原过敏并且反复喘息的儿童，将来进展为持续性哮喘的危险性明显增加[26]。本研究结果显示，复发喘息组婴幼儿血清IgE水平高于非复发喘息组(P<0.05)，提示过敏因素在婴幼儿喘息进程中的重要作用。根据ROC曲线得出，IgE对于婴幼儿早期喘息再发喘息具有一定的预测价值，对应的灵敏度为78.1%，特异度为71.4%。有研究表明，哮喘患儿体内总IgE水平有不同程度的升高，说明婴幼儿喘息性疾病与哮喘之间可能有共同的免疫学发生机制，喘息性疾病能否演变为哮喘，可以将婴幼儿时期喘息发作时的血清IgE水平作为一个重要的临床参数[27]。

综上所述，早期婴幼儿喘息患儿血清EDN、ECP和IgE可作为复发喘息的预测指标，可用来预测婴幼儿喘息复发，其中ECP在预测喘息复发中特异度最高，灵敏度最低，而IgE灵敏度最高，特异度最低，因此，同时检测ECP和IgE可能更好地预测早期婴幼儿喘息再发喘息的风险。