MARCH2在胃癌中的异常表达及临床意义

夏 丹

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其在东亚国家尤其是在中国发病率最高。胃癌是国内第三大肿瘤相关性死亡的主要原因[1]。MARCH2(membrane associated RING-CH protein 2)是MARCH家族的成员之一，含RING结构域，作为E3泛素连接酶，可调节细胞运输、DNA修复和信号转导等多种细胞活动。近年有文献报道MARCH2与病毒免疫逃逸蛋白密切相关，HIV-1感染时MARCH2表达水平升高[2]。MARCH2的泛素化底物包括Dsh[3]、CFTR[4]、β2AR[5]和DLG1[6]，其在肿瘤中的作用鲜有报道。本文应用免疫组化SP法检测MARCH2在125例胃癌组织中的表达，并探讨MARCH2表达与胃癌临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取2000年1月～2016年12月山东医学高等专科学校附属医院和北京大学第三医院存档的原发性胃癌手术切除标本125例及正常胃黏膜组织标本30例。其中男性96例，女性29例，中位年龄60岁(33～82岁)，所有患者术前均未行化疗、放疗及生物治疗。病理诊断及组织学分级均由两名病理医师确诊。所选病例临床资料完整，其中高分化腺癌1例，中分化腺癌28例，低分化腺癌96例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期26例，Ⅲ期76例，Ⅳ期12例；85例有淋巴结转移。标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片6张备用。收集患者的临床病理资料，包括患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期(UICC/AJCC 2010)。

1.2 试剂兔抗人MARCH2多克隆抗体(美国Abcam公司)；浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥公司)、SP免疫组化超敏染色试剂盒(福州迈新公司)。

1.3 方法采用免疫组化SP法染色，抗原修复为高压热修复，修复液使用1 mmol/L EDTA(pH 9.0)，一抗为MARCH2(1 ∶100)，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，DAB显色。用已知MARCH2阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定由两位病理医师独立阅片综合判断。每张切片随机观察5个有代表意义的高倍视野，每个高倍视野计数150～200个细胞，蛋白表达采用免疫反应评分(immunoreactivity score, IRS)，将着色细胞数比例与着色强度相结合。按着色细胞占计数细胞百分率计分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。按着色强度计分：未着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕色为3分。将两项得分结果相乘：0分为阴性(-)；1～4分为弱阳性(+)；5～8分为中等阳性()；9～12分为强阳性()。如果两名病理医师评分差异>3分，则该标本需重新评分。

1.5 统计学分析采用SPSS 15.0软件进行统计学分析，组间比较采用χ2检验，两变量之间的相关性采用Spearman等级相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MARCH2在胃癌组织中的表达MARCH2染色主要位于肿瘤细胞胞质和(或)胞核，呈弥漫棕色颗粒状(图1)。125例胃癌组织中MARCH2阴性34例，弱阳性21例，中度阳性53例，强阳性17例。MARCH2在胃癌组织中的阳性率为72.8%(91/125)。30例正常胃黏膜组织中MARCH2阴性23例，弱阳性7例。MARCH2在正常胃黏膜组织中的阳性率为23.3%(7/30)。MARCH2在胃癌组织中的阳性率明显高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。

2.2 MARCH2表达与胃癌临床病理特征的关系MARCH2表达与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期密切相关(P<0.01，表2)。MARCH2表达与患者年龄、性别和肿瘤直径无关。

图1 MARCH2在胃癌组织中的表达，SP法：A.MARCH2阴性；B.MARCH2弱阳性；C.MARCH2中度阳性；D.MARCH2强阳性

表1 胃癌及正常胃黏膜组织中MARCH2的表达

表2 MARCH2表达与胃癌临床病理特征的相关性

3 讨论

MARCH家族是一个结构上相关联的蛋白家族，其成员结构特点为由N端的RING-CH结构域和紧连的C端两个或多个跨膜区组成，这种跨膜RING-CH finger蛋白具有多种生物学功能，如免疫调节、蛋白质控和膜运输[7]。

目前MARCH家族有11个成员(MARCH-I-XI)[8]。MARCH-Ⅱ基因是Bartee课题组在2004年发现，定位于第19号染色体短臂13区2带(19p13.2)，基因全长25 746 bp，其开放读码框编码246个氨基酸，相对分子质量为2.6×104。TMHMM软件分析和功能结构域分析显示MARCH-Ⅱ是二次跨膜蛋白，由N端RING domain、中间的二次跨膜区和C端的PDZ domain构成。功能研究显示，MARCH-Ⅱ能降解细胞表面受体如转铁蛋白受体(TfR)和共刺激分子B7.2(CD86)[7]。应用免疫荧光观察到MARCH蛋白与内质网以及溶酶体共定位[7]。Xavier研究团队在HEK293T细胞中证实MARCH-Ⅱ也能定位在细胞膜上，通过其PDZ motif与DLG1相互作用促进DLG1泛素化，减弱DLG1在细胞连接点的表达，影响细胞的极性[9]。Shenoy课题组证实MARCH-Ⅱ能与β2AR相互作用，β2AR拮抗剂卡维地洛能够增强MARCH-Ⅱ与β2AR相互作用促进β2AR的内吞和溶酶体降解。MARCH-Ⅱ也能促进β2AR的泛素化，调节细胞表面的β2AR水平[5]。最近Guggino科研团队研究发现，在囊性纤维化支气管上皮细胞中MARCH-Ⅱ通过与CAL(CFTR相关的配体)和STX6结合泛素化并降解CFTR[4]。CFTR是质膜cAMP调节的Cl-通道，负责经上皮的盐和液体的运输。CFTR基因功能缺失性突变会引起致死性退行性基因遗传病囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)[10]。已有研究显示，CFTR缺陷会引起自噬的减低，导致蛋白聚集体的积累、肺部炎症和CF的发生。累积的数据显示，CFTR在肿瘤的进展和转移中发挥重要作用。根据肿瘤类型不同，CFTR遗传变异可能增高或降低肿瘤发生的风险[11-13]。目前研究尚不能确定在肿瘤细胞中CFTR和自噬之间的关系，且CFTR与MARCH2在自噬中的功能关系尚不清楚。

本组先前实验证实了MARCH2负向调控细胞自噬[14]；MARCH2过表达会损伤自噬，表现为过表达MARCH2导致LC3B-Ⅱ水平的减少和内外源性自噬性底物降解的减弱，该效应的发挥一方面牵涉PIK3CA/AKT-MTOR信号通路的活化，另一方面可能是通过与CFTR相互作用，促进其功能失活而实现的[14]。然而，MARCH2在肿瘤中的作用并不清楚。

本实验在前期研究基础上应用免疫组化法检测了自噬负向调节因子MARCH2在125例胃癌中的表达并且评估了MARCH2表达与临床病理特征的关系。本实验发现，MARCH2在胃癌中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织，提示MARCH2可能参与癌症的发生。本实验结果亦显示，MARCH2阳性染色更多出现在浸润深度更深、有淋巴结转移或更高TNM分期的胃癌组织中，提示MARCH2可能在肿瘤进展中发挥作用。这些结果提示MARCH2参与了胃癌的发生、发展，MARCH2可能成为胃癌诊断、治疗和评估预后的分子靶标。