头穴丛刺法联合川芎嗪对大鼠脑梗死后神经元突触重建的影响*

韩 慧,赖智勇,蒲建萍,刘玉珍

1.四川卫生康复职业学院临床医学系 (自贡 643000);2.四川省自贡市第一人民医院神经内科(自贡 643000)

脑梗死所致神经系统障碍相关研究为业界关注热点。研究认为[1]，急性脑梗死“治疗窗”短暂，但因神经结构及自愈可塑性特点，神经元突触可在脑梗死发病较长时间内调节改善，让梗死患者神经功能恢复成为可能[2]。故神经可塑性调节亦成为脑梗死靶点治疗主要研究方向。彭艳等[3]研究，神经元突触、星形胶质细胞与脑梗死神经功能恢复有着密切关联。而中医将脑梗死归纳“中风”范畴，且经历代医家积累丰富的脑血管疾病治疗经验，中药及穴位针刺方案成为脑梗死神经功能恢复优势方案，如川芎嗪、头穴丛刺法等方案对脑梗死患者神经功能恢复效果受到众医师认可[4-5]。但对于川芎嗪联合头穴丛刺法促进脑梗死神经功能恢复的神经行为学及神经细胞变化机制尚未明晰。对此，本研究以大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑梗死模型大鼠为研究对象，探析头穴丛刺法与川芎嗪对大鼠脑梗死后神经元突触重建的影响。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物：SD大鼠，雄性，周龄7～8周，体重200～280 g，平均(225±23)g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2018-0004。

1.2 试剂：盐酸川芎嗪，购自以岭药业(石家庄)股份有限公司，国药准字H20063094，规格2 ml：40 mg。0.9%氯化钠溶液购自滨湖双鹤药业有限公司，多聚甲醛(4%)购自拜意尔(武汉)生物科技有限公司。兔抗人突触素抗体、胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)单克隆抗体均购自Sigma公司。

1.3 仪器：BH-2型光学显微镜购自日本 OLYMPUS 公司，CH型投射电镜购自日本 OLYMPUS 公司。

2 实验方法

2.1 动物分组、模型备制及给药：取72只雄性SD大鼠，标准繁殖饲料喂养，环境温度22 ℃，相对湿度50%～60%，自适应喂养3 d，于MCAO造模术前12 h禁食，以线栓改良法行大脑中动脉阻断，包括颈总动脉分离、颈内外动脉、剪断颈外动脉并经颈外动脉插管注入栓子，造成局部脑梗死。模型备制成功标准：SD大鼠苏醒，行走呈偏左旋转，提尾悬空上肢无法向前伸，肢体疼痛收缩反应迟缓，伴或不伴“Horner征”。成功备制MCAO脑梗死模型后分为：A组18只(MCAO模型对照)，B组18只(头穴丛刺法)，C组18只(川芎嗪)，D组18只(头穴丛刺法+川芎嗪)。B组、D组取百会及穴位邻近左侧与右侧2 mm处针刺；C组、D组以盐酸川芎嗪注射液20 mg/(kg·d)；A组以同剂量0.9%氯化钠溶液注射。持续干预28 d，行后续实验。

2.2 神经元突触、星形胶质细胞个数观察：于MCAO建模7、14、28 d各组均取6只SD大鼠处死，脑组织取材，经70%～100%酒精脱水，浸蜡、包埋、切片、染色，CH型投射电镜下，8200倍视野，取20个观察区域，计算神经元突触、星形胶质细胞个数。

2.3 突触素、GFAP检测：于MCAO建模7、14、28 d各组均取6只SD大鼠处死，脑组织取材，免疫组织化学SP染色制切片，按照兔抗人突触素抗体、GFAP操作参照说明书执行，BH-2型光学显微镜下评估突触素、GFAP相关蛋白含量。

结 果

1 各组神经元突触、星形胶质细胞个数比较 随时间增长，各组神经元突触、星形胶质细胞个数均有增长，其中B、C、D组增长明显(P<0.05)；14 d、28 d D组神经元突触、星形胶质细胞增长个数显著高于A、B、C组，差异有统计学意义(P<0.05)，其次B、C组14 d、28 d 神经元突触、星形胶质细胞增长个数显著高于A组(P<0.05)，B、C两组7、14、28 d均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组神经元突触、星形胶质细胞比较(个)

注：与A组比较,*P<0.05;与B组比较,#P<0.05;与C组比较,△P<0.05

2 各组突触素、GFAP表达比较 随时间增长，各组突触素、GFAP表达均有提高，其中B、C、D组增长明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；14 d、28 d D组突触素、GFAP表达显著高于A、B、C组，差异有统计学意义(P<0.05)，其次B、C组14 d、28 d 突触素、GFAP表达显著高于A组，差异具有统计学意义(P<0.05)，B、C两组7、14、28 d均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组突触素、GFAP表达比较(μm2)

注：与A组比较,*P<0.05;与B组比较,#P<0.05;与C组比较,△P<0.05

讨 论

据调查[6]，国内脑梗死发病率为100/10万人，且超过80%因急性缺血性卒中所致。脑梗死可致失语、意识障碍、运动障碍、偏瘫等神经功能损伤症状，严重影响患者生存质量；同时脑梗死亦为国内死亡主要病因[7]。故怎样改善脑梗死患者神经功能损伤症状成为临床研究热点。大量研究证实[8-11]，中医疗法在缺血性脑梗死相关疾病及神经功能改善方面优势明显。刘峥等[12]指出，中药川芎成分提取物川芎嗪在缺血性脑损伤方面疗效确切，可通过抗炎、拮抗Ca2+离子，清除氧自由基，调控凋亡蛋白及调节神经可塑性等多个环节降低脑梗死损伤。针灸亦是世界卫生组织(WHO)认可且推荐的脑梗死神经功能恢复主要方案之一。徐飞等[13]结合脑梗死“津血同源”生化病因机制及“缺血半暗带”神经可塑性论点，提出头穴丛刺之法，以头穴刺激调节气血，活络益髓，调节阴阳。王建勋等[14]认为，针刺百会穴可抑制脑梗死组织脂质过氧化反应，减少氧自由基生应激，提高脑组织细胞存活率。黄金等[15]研究，针刺可促进梗死区域组织血运循环，提升神经细胞增殖效率，促进神经细胞形态结构的恢复。但关于头穴丛刺之法联合中药成分川芎嗪对脑梗死神经突出重建的相关机制研究尚未明晰。故本研究以SD大鼠建立MCAO脑梗死模型，评估头穴丛刺之法联合中药成分川芎嗪在脑梗死神经元突触及星形胶质细胞的恢复促进影响，为中医疗法治疗脑梗死及神经功能重建作用机理提供客观依据。

本研究中，MCAO脑梗死模型备制，经川芎嗪、头穴丛刺干预后，SD大鼠神经元突触、星形胶质细胞个数均明显增加，且随治疗期间增长逐步增多；其中又属川芎嗪联合头穴丛刺组改善情况最显著。分析机理可知，川芎嗪在活血(扩张血管)、化瘀(抑制血小板聚集)方面效果明显，改善脑梗死区域微环境，间接保护脑顶叶皮质细胞突触，同时川芎嗪抗氧自由基作用较好，调节缺血细胞自由基活性动态平衡，降低神经细胞损伤。而头穴丛刺亦刺激脑血流量增加，加速神经细胞增殖，提高突触效能传递，与李晓娜等[16]研究相符。证实川芎嗪、头穴丛刺可促进脑梗死大鼠神经元突触恢复，为神经功能恢复提供关键物质基础。

研究证实[17]，突触素密度与神经元突触发育有密切关联，同时突触素亦为神经可塑性主要评估标志物之一。GFAP则是评估脑梗死程度主要指标，亦是反应星形胶质细胞增殖及神经功能状态标志物[18]。故本研究重点观察突触素、GFAP，以此来客观评价川芎嗪、头穴丛刺在脑梗死大鼠神经功能恢复作用。本研究结果中，MCAO脑梗死大鼠突触素、GFAP表达随时间增长，均呈逐步升高进展，提示即便脑梗死发生后，神经功能亦有神经元突触调整与自我神经修复机制，而川芎嗪与头穴丛刺干预则可极大的加速神经重建。但通过比较发现，各组MCAO脑梗死7 d内突触素、GFAP表达并无明显差异，而在14 d后各组突触素、GFAP表达差异才明显表现。分析可知，脑梗死后神经系统重建恢复是调整、代替、适应等一系列的过程，在这一神经可塑环节前期，相关神经功能指标亦呈缓慢增长，至神经元突触及相关递质调节到一定程度才逐步显现差异。结合研究结果证实，川芎嗪联合头穴丛刺对突触素、GFAP表达促进效果最为明显，提高神经元突触发育及重塑性，调节神经元超微结构。

综上所述，川芎嗪联合头穴丛刺可促进MCAO脑梗死大鼠神经元突触增殖，增强突触素、GFAP表达，提高突触效能传递，为神经功能重塑提供基础，保护神经元超微结构，修复神经功能。