十二烷基硫酸钠强化柴胡皂苷的提取工艺

李 娇，李 江，付 鹏，彭 霜，阮志国，侯安国，柯 瑾

（云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500）

柴胡来源于伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense，DC.） 或 狭 叶 柴 胡 （Bupleurum scorzonerifolium Willd.） 的干燥根，为常用中药品种，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气之功，临床主要用于治疗感冒发热、寒热往来、肝郁气滞、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛[1]，现代药理学研究证明柴胡皂苷具有镇静、镇痛、抗炎、解热、抗肿瘤、增强免疫、保肝利胆、降血脂等作用[2]。柴胡主含皂苷、黄酮、多糖、挥发油等化学成分，其中皂苷类成分是其主要活性物质[3]，现行版《中国药典》将柴胡皂苷a、d 的总量作为质控指标。

目前柴胡皂苷的提取主要采用醇提法和水提法，醇提提取率相对较高，但成本也高，且后续操作繁琐，水提操作简单，但提取率低[4]。表面活性剂对于物质的溶出有一定的增溶作用，其在人参皂苷、苦瓜皂苷、无患子果皮皂苷、薯蓣皂苷[5-9]等成分的提取中已有报道，但未见使用表面活性剂辅助提取柴胡皂苷的文献研究，故本文采用表面活性剂强化提取柴胡中的柴胡皂苷，在单因素试验基础上，通过响应曲面法优化提取工艺，旨在提高以水作溶剂时柴胡皂苷的提取率。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

柴胡皂苷a 对照品（批号：110777-201711），柴胡皂苷d 对照品（批号：110778-201711） 均购自中国食品药品检定研究院；柴胡，云南昆明百草园药材经营部；乙腈，色谱纯；十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆188、吐温-80℃、甲醇、95%乙醇、正丁醇，均为分析纯。

Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；BT25S 电子分析天平（d=0.000 01 g），上海精密仪器仪表有限公司；CP124C 电子天平（d=0.000 1 g），奥豪斯仪器（常州） 有限公司；SHZ-D（Ⅲ） 循环水式真空泵，巩义市英峪予华仪器厂；DFY-500 摇摆式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司；HDM-3000 恒温电热套，常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件[10]色谱柱Agilent Zorbax C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈，洗脱梯度见表1；流速为1.0 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为30℃；进样量10 μL。对照品及样品色谱图见图1。

1.2.2 标准曲线的绘制取柴胡皂苷a、d 对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成每mL 含柴胡皂苷a 0.56 mg，柴胡皂苷d 0.54 mg 的混合对照品溶液。分别精密吸取柴胡皂苷a、d 混合对照品溶液适量用甲醇稀释成不同浓度的溶液，其中柴胡皂苷a 浓度为0.11 mg/mL、0.17 mg/mL、0.28 mg/mL、0.56 mg/mL、0.84 mg/mL、1.13 mg/mL，柴胡皂d浓 度 为0.11 mg/mL、0.16 mg/mL、0.27 mg/mL、0.54 mg/mL、0.80 mg/mL、1.07 mg/mL。按“1.3.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积，以峰面积值（Y） 为纵坐标，柴胡皂苷a、d 浓度（X） 为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，柴胡皂苷a 的回归方程为Y=1 737.5X-1.084 5（r=0.999 9），柴胡皂苷d 的回归方程为Y=2 354.8X-9.794 8（r=0.999 9），表明柴胡皂苷a 在1.125～11.25 μg范围内，柴胡皂苷d 在1.07～10.7 μg 范围与峰面积间有良好的线性关系。

表1 流动相洗脱梯度Tab.1 Mobile phase elution gradients

图1 对照品、样品HPLC 图Fig.1 HPLC of reference substances and samples

1.2.3 供试品溶液的制备及柴胡皂苷提取率的测定将柴胡粉碎过40 目筛后精密称取粉末20 g，按一定比例加入表面活性剂水溶液，加热回流提取一定时间，放冷，离心，取上清液转移至250 mL 容量瓶中，用纯水定容至刻度，摇匀，备用。精密吸取柴胡提取液10 mL 用水饱和的正丁醇萃取5 次，每次10 mL，合并萃取液，回收溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，进样，测定，计算柴胡皂苷a、d 总量。

1.2.4 单因素试验按照“1.2.3”项下方法，加热回流提取，其他条件固定不变，分别考察表面活性剂种类、提取时间、加液量、表面活性剂质量分数、提取次数对柴胡皂苷提取率的影响，分别确定各因素的最佳水平。

1.2.5 响应面法优化柴胡皂苷提取工艺在单因素的基础上，选取SDS 浓度（A）、提取时间（B）、加液量（C）、提取次数（D） 为变量，以柴胡皂苷a、d 总含量（Y） 为响应值，通过Box-Behnken 原理，采用四因素三水平响应面分析法优化柴胡皂苷提取工艺。因素与水平见表3，实验设计及结果见表4。

2 结果

2.1 单因素试验结果

2.1.1 表面活性剂种类对柴胡皂苷提取率的影响[11]称取柴胡粉末20 g，分别加入10 倍量质量分数为1%的不同表面活性剂水溶液，回流提取30 min。选取的表面活性剂为Tween 80、Poloxamer 188、SDS[12]，以纯水介质中的柴胡皂苷提取率为对照，实验结果见表2。

由表2 可知，三种表面活性剂对柴胡皂苷提取均有强化作用，其中强化效果最好的表面活性剂是SDS，在此条件下，柴胡皂苷提取率高达8.34 mg/g，为纯水提取率的6.2 倍，因此确定表面活性剂种类为SDS。

表2 表面活性剂对柴胡皂苷提取率的影响Tab.2 Effects of different surfactants on the extraction yield of saikosaponins

2.1.2 提取时间对柴胡皂苷提取率的影响称取柴胡粉末20 g，加入10 倍量质量分数为1%的SDS水溶液，加热回流提取条件下，考察不同提取时间对柴胡皂苷提取率的影响，见图2。

由图2 可知，柴胡皂苷提取率呈现先升后降的趋势，当提取时间为50 min 时，柴胡皂苷提取率最高，达到9.30 mg/g，60 min 时含量下降，可能与柴胡皂苷开始水解有关。故选择提取时间为50 min。

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 The effect of extraction time on extraction rate

2.1.3 加液量对柴胡皂苷提取率的影响称取柴胡粉末20 g，加入质量分数为1%的SDS 水溶液，加热回流提取50 min，考察不同加液量对柴胡皂苷提取率的影响，结果见图3。由图3 可知，在加液量为4～10 倍范围内时，柴胡皂苷提取率逐渐升高，继续增加溶剂用量，提取率增加很少，因此选择加液量为10 倍。

图3 加液量对提取率的影响Fig.3 The effect of liquid addition on extraction rate

2.1.4 SDS 质量分数对柴胡皂苷提取率的影响称取柴胡粉末20 g，分别加入10 倍量不同浓度的SDS 水溶液，加热回流提取50 min，考察不同浓度的SDS 水溶液对柴胡皂苷提取率的影响，见图4。由图4 可以看出，随着SDS 浓度的增大，柴胡皂苷提取率也随之增加，当浓度达1.25%时，提取效果最好，浓度达1.5%时，提取率反而下降。因此选择SDS 浓度为1.25%。

图4 SDS 质量分数对提取率的影响Fig.4 The effect of SDS quality fraction on extraction rate

2.1.5 提取次数对柴胡皂苷提取率的影响称取柴胡粉末20 g 加入10 倍量质量分数为1.25%的SDS 水溶液，加热回流提取50 min，考察不同提取次数对柴胡皂苷提取率的影响，结果见图5。由图5 可以看出，随着提取次数的增加，柴胡皂苷提取率略有增加，其中提取3 次和提取2 次的提取率接近。因此，从生产实际考虑提取次数选择2 次即可。

综上所述，单因素最佳参数水平分别为：1.25%SDS、加液量10 倍、提取时间50 min、提取次数2 次。

图5 提取次数对提取率的影响Fig.5 The effect of extraction times on extraction rate

2.2 响应面法工艺优化结果分析

2.2.1 响应面设计在单因素的基础上，选取SDS浓度（A）、提取时间（B）、加液量（C）、提取次数（D） 为变量，以柴胡皂苷a、d 总含量（Y） 为响应值，通过Design-Expert.V 8.0.6 软件[13]，采用四因素三水平响应面法优化柴胡皂苷提取工艺因素与水平表见表3，实验设计及结果见表4。

2.2.2 方差分析与显著性检验采用Design-Expert8.0.6 软件对柴胡提取工艺各因素进行回归拟合，得回归方程Y ＝12.50+0.1A+0.22B+0.31C+1.33D-0.14AB+0.41AC-0.017AD-0.29BC+0.34BD-0.48CD-0.78A2-0.91B2-0.31C2-1.35D2。对该数学模型进行方差分析和显著性检验，见表5。由表5 可知，模型的决定系数R2=0.9125，P＜0.000 1 说明模型具有较高的显著性，且失拟项P=0.903 3，失拟项不显著，说明回归方程拟合度良好[13-14]。各因素对柴胡皂苷a、d 总含量的影响为：提取次数＞加液量＞提取时间＞SDS 浓度，D 因素对响应值的影响极显著[15-16]。二次项A2、B2、D2 对柴胡皂苷a、d 总含量的影响显著，说明各因素与响应值不是简单的线性关系。

2.2.3 响应面分析采用Design-Expert 8.0.6 软件，根据拟合模型绘制柴胡中柴胡皂苷含量响应面的响应面图（图6） 与等高线图（图7），可得到各参数范围内的极值及因素间相互作用对响应值的影响。

2.2.4 最佳工艺与验证试验通过Design-Expert 8.0.6 软件预测分析得到最佳提取工艺条件为：SDS浓度1.28%，提取时间52.09 min，加液量10.16倍，提取2.50 次。为方便操作将最优工艺调整为：SDS 浓度1.28%，提取时间52.09 min，加液量10.16 倍，提取2.0 次。按此条件进行3 次平行试验验证，求平均值，所得结果（12.82 mg/g） 与模拟值（12.87 mg/g） 相差不大（SD=0.05%），说明响应面法优化柴胡皂苷提取工艺条件准确可靠。

表3 响应面因素水平表Tab.3 The response surface factor levels

表4 响应面试验设计与结果Tab.4 The test design and results of response surface

表5 回归模型的方差分析Tab.5 Analyses of variance of regression models

图6 各因素交互作用响应曲面图Fig.6 Response surfaces of various factors'interaction

3 讨论

柴胡作为传统常用中药，在我国已有2000 余年的应用历史，其主要含有柴胡皂苷、挥发油、多糖、黄酮、甾醇等成分。柴胡皂苷类作为柴胡的主要活性成分，属于三萜皂苷类化合物，常用的提取方法为溶剂提取法，目前文献报道多以乙醇-水、碱性试剂-乙醇-水、水作为提取溶剂，而提取效果差异较大，尤其以水作为提取溶剂，柴胡皂苷的溶出度最低[17-19]。柴胡皂苷a 结构中含有环氧醚环，该结构不稳定，在提取过程中容易开裂造成结构转化，导致提取液中柴胡皂苷a 的含量降低[20]，但碱性溶剂作为提取溶剂时对该过程有抑制作用。然而，在实际生产过程中，柴胡通常是和其他药材一同提取，采用碱性乙醇作为溶媒，虽然可以提高柴胡皂苷a 提取率，但碱性环境对其他成分可能造成影响，故多以中性溶剂进行提取，如中性50%乙醇[18]。

表面活性剂含双亲结构，能使溶液的表面张力显著降低，对物料具有界面吸附和分散作用，可以增强溶剂对物料的润湿性和渗透性，从而增加提取率、降低提取时间及成本，在辅助提取植物的活性成分方面应用广泛[21]。本研究考虑加入表面活性剂，以增加柴胡皂苷的溶出，提高柴胡皂苷的提取率。

Box-Behnken 响应曲面分析法相对于正交试验设计具有预测性好、精确度高的特点，本研究在单因素试验的基础上用响应面法优化柴胡的提取工艺，可连续对整个区域的各水平进行分析，极大程度优化了柴胡的提取工艺。柴胡在中医临床使用的主要形式是汤剂，而水作为提取溶媒，显示出对柴胡皂苷较低的提取率，加入十二烷基硫酸钠，同时采用响应面法确定了最佳提取工艺，增加了柴胡的提取率，为柴胡皂苷提取提供了一定的参考。

本研究中加入了表面活性剂，虽然增加了柴胡皂苷的提取率，但是在进行含量测定时发现，与未加表面活性剂的相比，表面活性剂会对柴胡皂苷a、d 的分离度造成影响，导致分离度减小，甚至造成分离度无法符合分析要求。因此在供试品制备过程中可采用萃取的方法。但萃取时十二烷基硫酸钠与正丁醇会造成分层不明显，所以采用离心法，4 000 r/min 离心10 min，以除去十二烷基硫酸钠对实验的干扰。