药用植物紫锥菊叶的显微鉴别研究

王德民，李敏，李峰

（山东中医药大学药学院，山东 济南 250355）

紫锥菊［Echinacea purpurea（L.）Moench］，又称松果菊，为菊科松果菊属植物，该属植物已知的有9个种及数个变种［1］，目前被作为药物开发应用的主要有紫锥菊、狭叶紫锥菊［Echinacea angustifolia（DC.）Hell］和淡紫松果菊［Echinacea pallida（Nutt.）Nutt］［2］。紫锥菊原产于北美，是西方国家民间的传统草药，药用历史悠久，最早可追溯到北美洲的印第安人时期，用来治疗蛇蚁叮咬及疱疹［3］。现代科学研究证明，紫锥菊兼具突出的抗感染和促免疫作用［4-8］。从20世纪开始，紫锥菊作为广受瞩目的免疫调节剂和免疫抑制剂受到国际社会的普遍认可；含有紫锥菊的药物制剂先后在德国、美国、加拿大等西方国家上市，并扩大应用到保健品及食品领域中，以紫锥菊为原料的产品年销量常年名列前茅，是国际上公认的免疫和抗病毒双效草药［9，10］。20世纪70年代，我国将紫锥菊作为观赏花卉引入，并首次收载于《北京植物志》中［11］；90年代，紫锥菊首次作为免疫调节剂被肖培根院士介绍到国内，随即在我国南北多地相继开始该属三种药用植物的栽培研究工作，并取得了一定的成果［3，12］。2012年6月，紫锥菊及其制剂被农业部批准为国家一类新兽药，并收载于《中华人民共和国兽药典》［11］。紫锥菊为多年生草本植物，多采收于枝叶繁茂的盛花期，目前国内市场上流行的生药大宗通货多由其花、茎、叶等地上部分组成。有学者对该植物不同生长期主要有效成分菊苣酸等的含量进行动态分析发现，盛花期该植物的主要有效成分达到最高值，且叶为含量最高部位［13］。

目前国内有关紫锥菊的研究报道较传统中草药相对较少，主要集中在生药学［2，4］、有效成分［5-8］、药理药效［3］等方面，对紫锥菊叶的系统研究鲜有报道，而且目前对紫锥菊叶的显微鉴别描述尚存在一定分歧，尤其对叶横切面的内部结构、表皮非腺毛种类等的观察结果有所异议［9，13-15］。因此，笔者从表面特征、内部结构、粉末特征方面对紫锥菊叶进行系统的显微鉴别研究，以期为紫锥菊的相关研究和开发应用提供更多的数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

本实验所用样品于2019年5月取自山东中医药大学药用植物园，由山东中医药大学生药系李峰教授鉴定为菊科植物紫锥菊［Echinacea purpurea（L.）Moench］的新鲜叶片。

所用药剂为水合氯醛、稀甘油等。所用仪器包括显微镜系统（CX41 System Microscope，OLYMPUS公司产品）；显微数码相机（TOUPCAMTM，P/N TP603100A）；成像软件（ToupView）；高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司，FW-100）等。

1.2 实验方法

1.2.1 叶表面制片 取紫锥菊成熟叶一片，清理表面灰尘后将叶片置于适量蒸馏水中浸泡30 min，取出吸去多余水分，撕取叶片中部近中脉一侧的叶上下表皮，迅速浸入蒸馏水中。上、下叶表皮分别制片。将所制备的装片置于显微镜下观察、描述，并对显著特征进行拍照。

分别随机选取相同倍数下观察到的叶上、下表皮视野各10个。按《中华人民共和国药典》（2015）通则中的公式I＝（S×100）/（E+S）计算气孔指数，其中，I表示气孔指数，S表示气孔数，E表示同一视野内表皮细胞数。最后取平均值作为最终结果。

1.2.2 叶横切面制片 取样品成熟叶一片，清理表面灰尘后切成1 cm×2 cm的短段，置于蒸馏水中浸润后用刀片重复切片，切至肉眼观察呈半透明状。选择较完整的切片制作临时装片，方法同叶表面制片，置于显微镜下观察、拍照并描述。

1.2.3 叶粉末制片 取样品叶片适量，清理表面灰尘后进行干燥并粉碎，过60目筛，用水合氯醛、稀甘油制成临时装片，置于显微镜下观察、拍照、描述。

2 结果与分析

2.1 紫锥菊叶表皮特征

紫锥菊叶上表皮细胞呈不规则多角形，长51～110μm，宽25～59μm，垂周壁呈微波状弯曲，排列紧密，气孔偶见，为不定式，周围副卫细胞3～4个。下表皮细胞呈不规则形，长52～100 μm，宽20～65μm，垂周壁样式为深波状弯曲，气孔众多，为不定式，保卫细胞半月形，周围副卫细胞3～4个，可见两个气孔共用一个副卫细胞（图1）。表皮非腺毛偶见，分为四种：第一种为多细胞圆锥状，先端锐尖，壁较厚，细胞腔狭小，表面具有明显的疣状突起；第二种为多细胞棒状，壁略厚，先端较钝，表面有疣状突起；第三种为单细胞圆锥状，先端锐尖，壁厚，细胞腔狭小，表面光滑；第四种为星状毛，偶见。叶上表皮的气孔指数为1.455；叶下表皮的气孔指数为19.884（表1）。

表1 紫锥菊叶表皮气孔指数

2.2 叶横切面特征

通过显微鉴别，紫锥菊叶为典型的异面叶。上、下表皮细胞各一列，近似长方形，外有角质层覆盖，细胞外有非腺毛疏被；气孔上、下表皮均有，下表皮数量远大于上表皮。叶肉组织分为两种，分别为栅栏组织和海绵组织，栅栏组织位于叶上表皮内侧，组织细胞有两列，呈长柱形，外层细胞排列较内层更为紧密；海绵组织位于叶下表皮内侧，组织细胞多列，形状不规则，排列疏松，有较大的细胞间隙；叶肉组织中含有大量的叶绿体；中间可见维管束存在。主脉处上、下表皮细胞呈类圆形或类方形，细胞外也有角质层覆盖，内侧为厚角组织，细胞壁不均匀加厚；主脉维管束发达，为外韧型，呈弧形，数量1～3个不等，具有明显的形成层，薄壁细胞组成一层维管束鞘包围在维管束外侧（图2）。

图2 紫锥菊叶横切面特征显微观察

2.3 叶粉末特征

紫锥菊叶粉末为浅绿色。非腺毛可见四种，一为多细胞圆锥状，先端锐尖，壁较厚，细胞腔狭小，表面具有明显的疣状突起；二为多细胞棒状，壁略厚，先端较钝，表面有疣状突起；三为单细胞圆锥状，先端锐尖，壁厚，细胞腔狭小，表面光滑；四为星状毛，偶见。表皮细胞形状不规则，垂周壁呈微波状弯曲或深波状弯曲，不定式气孔，周围副卫细胞3～4个。保卫细胞半月形，且可见有两个气孔共用一个副卫细胞。导管多数以螺纹导管为主，网纹导管偶见。部分可见石细胞。多见角质样物质，有明显的不规则线状纹理。偶见未成熟的花粉粒（图3）。

图3 紫锥菊叶粉末显微观察

3 讨论与结论

紫锥菊并非传统的中草药，且引入我国时间相对较短，故国内目前对紫锥菊的生药研究相对较少，多围绕其化学成分及药效药理作用开展，且受众目标多为家禽畜类。近年来，随着紫锥菊在国内引种栽培技术的不断提高和其生药商品流通性的不断增加，该属植物的“中国化、中药化”进程也随之加深，为紫锥菊这种舶来品逐渐探索出中医药理论依据［16］。虽然当前国际上该种植物的应用范围正在不断扩大，国内相关领域学者也加深了对其的研究，并取得了一定的研究结果，但紫锥菊还未作为药用植物收录到《中华人民共和国药典》中，因而目前国内未有规范、专属性强的鉴别方法。国内对紫锥菊叶的研究在该属植物的生药学等宏观角度中有所涉及［14］，但缺乏单独对紫锥菊叶进行研究的报道；也有科研人员［17］采用扫描电镜对其叶部进行研究，但该方法所需设备成本较高，操作相对复杂，不具有普适性；已发表文献中紫锥菊叶面结构类型的鉴别结果存在差异。因而，对紫锥菊叶进行相对独立的研究就显得尤为重要。

本研究对紫锥菊叶进行了显微结构的观察，对叶片上、下表皮分别进行单独观察、拍照、描述，并计算气孔指数。结果表明，紫锥菊叶组织结构特征具有菊科植物的共性，叶上、下表皮细胞形状、垂周壁、不定式气孔、副卫细胞数目、维管束类型等均与相关文献报道［9，15］基本一致；其叶上表皮的气孔指数1.455，下表皮气孔指数19.884。

同时也有一些值得商榷的地方：第一，观察中发现紫锥菊叶的非腺毛有四种，除前人［9］观察到的多细胞圆锥状和多细胞棒状以外，还观察到了单细胞圆锥状和星状毛。第二，紫锥菊叶为异面叶而非报道［14］中的等面叶，栅栏组织仅存在于上表皮内侧。第三，观察发现主脉维管束有分离的情况，个数1～3个不等，主脉维管束的个数与维管束在主脉中位置有关，也与叶片的大小和发育程度有关，即同一叶片，主脉从叶基部至叶尖端，维管束逐渐分离；相同发育程度下不同叶片的相同位置，较大的叶片中维管束分离的占大多数，较小的叶片维管束多不分离；不同发育程度叶片的相同位置，发育成熟叶片的维管束多分离，未发育成熟叶片的维管束多不分离。第四，首次在紫锥菊叶粉末中观察到石细胞。第五，在紫锥菊叶粉末中观察到角质层样物质，该物质具有明显的不规则线状纹理。第六，关于紫锥菊叶粉末的研究，有文献［18］指出其粉末中含有草酸钙簇晶和草酸钙柱晶，此次观察未发现有这两种物质；在紫锥菊叶粉末中，还偶见未成熟的花粉粒。以上所列观点，或与相关文献记载不符，或未见于文献记载。

同为菊科紫锥菊属的狭叶紫锥菊和淡紫松果菊，在《美国药典》中均有收录，可作为制剂研发的正品植物来源，本课题组其他研究中样品收集情况的反馈表明，国内目前栽培种以紫锥菊与狭叶紫锥菊为主，淡紫松果菊少有种植（尚未发表）。将狭叶紫锥菊和淡紫松果菊以往研究资料［14，19］与本研究中紫锥菊叶片显微研究结果横向对比发现，叶部显微存在以下异同点：①在横切面观察中，狭叶紫锥菊和淡紫松果菊的叶面类型为等面叶，上下表面均为栅栏组织；而本研究中紫锥菊为异面叶。②叶中脉维管束，三种植物均为外韧型，形成层可见。③三种植物上下表皮均发现多细胞非腺毛，且非腺毛种类相同；本研究中观察到的非腺毛类型为四种，首次发现单细胞圆锥状和星状毛。④在叶片粉末观察中，三种植物的气孔类型均为不定式。其中，叶面类型的异同可考虑作为紫锥菊与狭叶紫锥菊、淡紫松果菊的显微鉴别要点。

本研究结果可作为对紫锥菊相关研究内容的补充与完善，为紫锥菊的研究提供了更加全面的参考资料。