富血小板血浆对兔腰背根神经节细胞凋亡的影响

董晤讯，马勇，郭杨，朱爱洪，朱亚亮，黄浩，于辉，于晖曜

作者单位：1南京中医药大学第一临床医学院骨伤研究所，江苏 南京210023；2常州市金坛区中医医院骨伤科，江苏 常州213200

腰椎间盘突出症是临床上极为常见的疾病，其发病率较高[1]。近几年，富血小板血浆（Platelet Rich Plasma，PRP）用于组织再生与修复已经被临床医生和科研人员广泛采用，主要包括组织再生和组织修复[2]。PRP是从全血中提取出来的血小板浓缩液，含有高浓度的血小板。而每个成型血小板中含有超过30种生物活性蛋白，其中大多数在组织修复中起基础作用[3]。研究表明，机械性压迫与炎症化学性刺激是腰椎间盘突出后引起腰脊神经根病理生理变化的重要原因[4]。本研究将兔自体髓核组织移植于腰背根神经并结扎神经根，制作兔腰背根神经机械性压迫、炎性损伤动物模型，该模型除了能产生机械压迫及脊神经根缺血的病理改变外，还能通过自体髓核移植产生大量炎性因子，刺激神经根，能较稳定、长久地产生神经痛样的改变，能较好地模拟人类腰椎间盘突出症的发病机制。建模后观察自体PRP干预后腰背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）组织学形态及细胞凋亡情况。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 研究时间为2017年10月至2018年2月，实验动物为健康新西兰兔48只，雌雄各半，体质量范围为1.5～2.0 kg，由南京中医药大学实验动物中心提供并饲养（动物合格证号：201720320）。所有兔均分笼，适应性饲养1周，每日供应足量食物和水，定期更换托盘垫料、消毒和通风。饲养室温度维持在20～25℃，湿度50%～80%，模拟昼夜照明。所有实验操作步骤均轻柔，避免过度刺激实验兔引起紧张。将实验兔按随机数字表法分为治疗组、对照组、假手术组，每组16只。其中造模术后由于失血过多死亡6只，依次补齐后进行实验。本研究符合一般动物试验伦理学要求。

HE染色试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法）（上海碧云天生物技术有限公司）；凝血酶（Sigma公司，美国）；抗凝剂枸橼酸钠（南京中医药大学实验中心）。高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；Image Pro Plus 6.0图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）。

1.2 PRP制备 使用10 mL无菌注射器，吸取20%枸橼酸钠润管，抽取治疗组耳中动脉血约8 mL，其中2 mL用于血小板计数，剩余6 mL置入含有枸橼酸钠抗凝剂的离心管内用于制备PRP。根据Aghaloo二次离心法，首先以215 g离心10 min，吸取白膜层以上血浆置入另一离心管内进行二次离心，以863 g离心10 min，去除上清，留取下层约0.8 mL液体摇匀，即为PRP。取0.2 mL PRP用于血小板计数，剩余0.6 mL PRP中加入0.06 mL凝血酶（浓度1 000 U/mL，溶剂为10%氯化钙），激活PRP以凝集成胶状。

1.3 模型制备及实验方法［5］实验新西兰兔采用耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠，按1 mL/kg麻醉，麻醉成功后，将兔俯卧位固定，常规碘伏消毒，铺无菌洞巾。以腰4棘突旁开1 mm为中点，顺棘突方向切开，切口约长4 cm，沿棘突右侧剥离髂棘肌并向一侧分开。咬除L4、L5右侧椎板、关节突和部分椎弓根。显露右侧硬脊膜及L4的右侧神经根。假手术组不作干预，治疗组与对照组采用4-0铬制肠线环扎L4背根神经，松紧度以背根神经略受压变形为度。截断兔尾，取一个椎间盘的髓核，将其移植到右侧L4神经节周围。行相应治疗后缝合切口。

1.4 治疗及观察方法 治疗组兔模型将凝胶状PRP置于DRG周围后缝合切口，对照组兔模型则置入等体积自体脂肪后缝合切口，假手术组不作干预缝合切口。术后3组兔均肌内注射青霉素40万U抗炎治疗。术后分别于24、48、72、96 h 取DRG，HE 染色观察组织学形态，TUNEL法染色，镜下观察并计算阳性细胞数。

1.5 观察指标

1.5.1 DRG组织形态学观察 测定机械刺激痛阈值后，将3组兔取出的右L4 DRG以生理盐水冲洗后，投入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，以备制作光镜标本。病理组织切片按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，HE染色、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察各组织形态学变化。

1.5.2 TUNEL染色观察DRG细胞凋亡 ①将3组DRG石蜡切片常规脱蜡、复水。②滴加3%过氧化氢1 mL，阻断内源性辣根过氧化物酶。③滴加0.1%TritonX-100使细胞膜的通透性增加。④PBS、双蒸馏水冲洗。⑤标记：滴加TUNEL反应混合液50微升/片。⑥信号转化和分析：加入转化剂-POD（酶标记抗荧光素抗体）、DAB、苏木精复染、脱水、透明、封片。光学显微镜下观察3组兔DRG细胞凋亡率，分析结果，阳性细胞细胞核为棕黄色。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件包处理数据结果。计量资料用表示，多组多时点比较采用两因素重复测量方差分析，组间精细比较为LSD-t检验，时间精细比较为差值t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血小板计数 兔耳中动脉血中血小板计数为（191.93±12.50）×109/L。 PRP 中 血 小 板 计 数 为（879.06±24.70）×109/L，约为外周血的4.59倍，达有效治疗浓度标准。

2.2 组织形态学观察 各组兔于术后各时间点麻醉后，暴露结扎的DRG。术后24 h、48 h肉眼见DRG轻度水肿，与周围组织无粘连。术后72 h、96 h肉眼观察对照组可见DRG水肿，与周围组织粘连；治疗组DRG水肿程度较低，与周围组织无粘连，可轻易游离DRG；假手术组未见DRG水肿。术后96 h HE染色：可见对照组、治疗组细胞排列规则，细胞间隙无明显增宽；对照组神经元皱缩，排列欠规则，细胞间隙宽，尼氏小体变少，细胞核缩小；假手术组无明显病理变化。

2.3 TUNEL染色观察DRG细胞凋亡 治疗组四个时间点，TUNEL阳性细胞数均低于对照组（P＜0.05）；对照组术后随时间延长TUNEL阳性细胞数逐渐增加（P＜0.05）；治疗组与假手术组相比，在各个时间点阳性细胞数差异有统计学意义（P＜0.05）。假手术组与对照组相比，各时间点阳性细胞数均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 三组兔富血小板血浆对腰背根神经节细胞凋亡的影响/（个，）

表1 三组兔富血小板血浆对腰背根神经节细胞凋亡的影响/（个，）

注：与假手术组同时点比较，aP＜0.05，与对照组同时点比较，bP＜0.05；与组内24 h比较，cP＜0.05

images/BZ_111_238_1663_1192_1725.png对照组治疗组假手术组整体分析（HF系数）组间F值，P值时间F值，P值交互F值，P值16 16 16 21.93±2.44a 9.09±1.39ab 5.36±1.05 24.34±3.82ac 12.32±0.85abc 5.27±1.22 23.83±3.30ac 14.55±0.79abc 4.20±0.46c 27.45±1.44ac 15.29±0.98abc 4.98±0.72 0.8894 3，401.938，0.000 29.011，0.000 12.385，0.000

3 讨论

细胞凋亡是由基因控制的一种程序性死亡过程，这一过程涉及有多个基因及神经生长因子的参与[6-10]。有研究发现脊神经根受损后，可出现长达数月的神经元凋亡[11-12]。腰椎间盘突出压迫造成神经根损伤，可引起DRG内细胞凋亡。本研究通过对兔背根神经结扎加自体髓核移植，对神经根产生机械性压迫。同时破裂的髓核释放的化学性物质作用于神经根产生炎症反应[13]，造成神经根损伤。在本研究各时间点中，对照组DRG中细胞凋亡率明显高于假手术组（P＜0.05），表明该模型可以诱导DRG的神经元凋亡。

PRP疗法已经成为增强组织修复和再生的潜在方法，其临床应用已经扩展到口腔科、皮肤科、眼科、骨科和运动医学等专业领域。一项PRP联合同种异体骨移植治疗骨缺损的随机临床对照试验展现了PRP在组织修复方面的能力[14]。PRP中富含高浓度血小板，通过氯化钙及凝血酶激活后可释放多种生长因子，其活性可持续5～8 d[15]。有研究表明，PRP中肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）参与抗炎症过程[16]，HGF可特异性抑制E-选择素，进而诱导抗炎细胞因子[17]；此外，HGF可通过抑制NF-κB通路的活化，来降低促炎细胞因子TNF-α基因的转录[18]。在小鼠皮瓣缺血再灌注损伤实验中，PRP可以抑制NF-κB通路及TNF-α的表达[19]。在对坐骨神经损伤的研究中，发现PRP可增强周围神经修复能力，可能与PRP中的生长因子参与了神经再生过程有关[20]。在另一项研究中，发现PRP可降低Bax基因表达，进而抑制凋亡[21]。有研究表明PRP可促进神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）表达，这对背根神经节修复具有重要意义[22]。本研究发现，对照组TUNEL阳性细胞数明显高于治疗组与假手术组（P＜0.05），提示自体PRP可以明显抑制DRG神经元凋亡。

据上所述，本研究结果表明，在兔神经根压迫及炎症模型中，使用自体PRP治疗后，可显著降低术后96 h DRG细胞凋亡率，抑制细胞凋亡，对神经元具有保护作用，未来通过进一步研究，可能为椎间盘突出症病人的治疗提供新的选择。