甘蓝夜蛾核型多角体病毒DNA解旋酶2的原核表达研究

杨杰，徐闻，孙项，周吟

（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430068）

农业昆虫取食农作物，往往会造成较大经济损失，目前用得较多的是化学农药。但化学农药的使用对环境有危害，对人也有毒性。杆状病毒可以作为生物农药使用，但是杀虫谱比较窄。传统观点认为，一种昆虫杆状病毒只能防控一种害虫。农作物常常被多种害虫取食，导致普通的昆虫病毒因为杀虫谱较窄，限制了实际应用。甘蓝夜蛾核型多角体病毒（MbMNPV）是一种广谱性昆虫病毒，能杀灭32种鳞翅目害虫，其中包括有甘蓝夜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾、小地老虎、黄地老虎、粘虫、稻纵卷叶螟和豆野螟等多种农业重要抗性害虫[1]。

截止目前，杆状病毒中多个基因被认为和病毒的宿主域相关，如已有p35、病毒DNA解旋酶p143、lef7和ie-2等[2]，其中DNA解旋酶p143基因不仅参与了DNA复制，也是最早被发现的与病毒宿主域相关的基因。不同杆状病毒的宿主域并不相同，如苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV）可以感染超过40种昆虫种类，而家蚕核型多角体病毒（BmNPV）只能感染家蚕这1种宿主，当AcMNPV中p143发生突变以后，就具有感染家蚕的能力[3]。

在MbMNPV的基因组中，除了存在解旋酶基因以外，还存在第2个拷贝的“截短版”DNA解旋酶基因（helicase 2，简称为hel-2），hel-2基因只在6种核型多角体病毒（NPV）中存在，但是几乎在所有颗粒体病毒（GV）中都存在，两个DNA解旋酶基因可能有共同的祖先，但hel-2基因序列更加保守[4]。

为了确定hel-2基因是否与病毒的宿主域相关，可以对该蛋白进行原核表达并纯化后，检测其能否对不具有广谱杀虫活性的NPV起到扩大杀虫谱的作用。本文克隆了甘蓝夜蛾核型多角体病毒hel-2基因，并在大肠杆菌中进行了原核蛋白表达。

1 材料与方法

1.1 材料

MbMNPV由中国科学院武汉病毒研究所张忠信研究员惠赠。大肠杆菌DH5a和BL21菌种来自本实验室保存。DNA polymerase购自北京擎科新业生物技术有限公司，限制性内切酶NotI和XhoI，T4 DNA连接酶购自 TAKARA 公司，DL2000 DNA Ladder、DL5000 DNA Ladder蛋白质 Marker、ECL Plus超敏发光液、小鼠抗His-tag抗体、HRP标记山羊抗小鼠二抗购自北京索莱宝科技有限公司，质粒抽提试剂盒（Plasmid Mini Kit I）和胶回收纯化试剂盒（Gel Extraction Kit）购自 Omega Bio-tek 公司。

1.2 方法

1.2.1 设计引物

通过碱裂解法抽提甘蓝夜蛾核型多角体病毒的基因组DNA[5]，以该总DNA为模板，根据NCBI数据库中MbMNPV中helicase 2的DNA序列设计hel-2引物：上游引物为5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCA TGAAGCGCACTAGTGTC-3'，下游引物为5'-CCG CTCGAGTTATAACACAAGGTTGGG-3'，进行甘蓝夜蛾核型多角体病毒hel-2基因的PCR扩增。

1.2.2 表达载体的质粒构建和鉴定

将pET28a和上述hel-2的PCR产物分别经NotI/XhoI双酶切，再用胶回收试剂盒进行切胶回收，按照其说明书步骤进行，将hel-2和pET28a胶回收产物在4 ℃进行过夜酶连，转化感受态细胞大肠杆菌DH5，经过卡那霉素平板筛选得到阳性转化子。挑取单菌落接种到液体LB培养基中，使用质粒抽提试剂盒提取质粒，并使用NotI和XhoI进行双酶切，并进行琼脂糖电泳检测验证。

1.2.3 蛋白的诱导表达和蛋白质免疫印迹鉴定

将构建成功的载体转化到感受态细胞大肠杆菌BL21，挑取单菌落接种到液体LB培养基中活化过夜，再将菌液以1∶100的浓度接种到10 mL液体LB中，37 ℃培养3 h，再加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至不同终浓度（1 mg/mL），摸索诱导条件，超声破碎细菌，分别收集上清与沉淀，进行SDSPAGE检测，并使用His-Tag抗体，进行免疫印迹检测。

2 结果与分析

2.1 pET28a-hel2原核表达载体构建

首先提取MbMNPV的基因组DNA，再以该基因组DNA为模板，使用sense和antisense引物扩增helicase 2基因，PCR产物进行DNA电泳检测，结果如图 1 所示，helicase 2 基因的长度为 1 368 bp，产物大小与预期一致。

图1 hel-2基因PCR扩增产物

对该PCR产物和pET28a载体分别用NotI/XhoI进行双酶切，对酶切后的产物DNA凝胶电泳和切胶回收后，进行酶连转化，对转化平板上的单菌落抽提质粒，使用NotI/XhoI进行双酶切验证。结果如图2所示，载体片段大小和外源目的片段大小（1 368 bp）与预期一致，表明hel-2基因片段已经连入表达载体pET-28a，将酶连产物送到测序公司进行测序验证，结果显示序列正确无误。

图2 重组质粒pET28a-hel2质粒酶切电泳图谱

2.2 Hel-2蛋白诱导条件摸索

在诱导温度37 ℃、0.4 mmol/L的IPTG浓度下，检测了不同诱导时间对Hel-2蛋白表达的影响，收集IPTG诱导不同时间的BL21菌体，超声破碎菌体后分别收集沉淀与上清，使用SDS-PAGE检测，结果如图3所示。诱导后1 h开始，可以在沉淀中检测到目的蛋白表达，与预期大小一致，随着诱导时间的增加，还是只能在沉淀中检测到目的蛋白表达，而上清液中没有检测到目的蛋白表达。

图3 不同诱导时间下Hel-2蛋白表达的SDS-PAGE图谱

为了增加蛋白的可溶性表达，决定尝试低温诱导的方式，诱导温度18 ℃，诱导时间为16 h，在不同IPTG浓度下进行诱导，收集不同IPTG诱导浓度的菌体，超声破碎菌体后分别收集沉淀与上清，使用SDSPAGE检测，结果如图4所示。低温诱导的Hel-2蛋白还是只在沉淀里表达，在上清里面没有检测到目的蛋白，但与37 ℃诱导条件相比，沉淀中的目的蛋白生成总量有所降低。

图4 不同IPTG浓度下Hel-2蛋白表达的SDS-PAGE图谱

2.3 Hel-2蛋白的免疫印迹验证

在多种诱导条件下，Hel-2蛋白都以沉淀形式表达，在上清中没有检测到可溶性表达的蛋白，Hel-2蛋白带有His-tag标签，所以采用His-tag抗体检测了 37 ℃、0.4 mmol/L IPTG 诱导条件下，Hel-2 融合表达蛋白的表达情况，结果如图5所示。上清中没有任何信号，沉淀中能在约58 kDa处有Hel-2蛋白的表达，此外还有2个非特异性条带。该结果进一步验证了SDS-PAGE的结果，Hel-2蛋白全部以包涵体的形式表达，上清中并无可溶性表达产物。

图5 Hel-2蛋白的免疫印迹结果

3 结论

将甘蓝夜蛾核型多角体病毒的解旋酶2进行原核表达，结果显示该蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，上清液中没有检测到可溶性表达蛋白，这可能是解旋酶2与DNA复制过程相关，表达产物对细菌有毒性，因此以包涵体形式表达。未来可以通过在真核细胞内将该蛋白表达，并进一步探究该蛋白是否影响了病毒的广谱杀虫功能。