血清、尿液和唾液在婴幼儿巨细胞病毒DNA 检测的应用价值

冼剑威，邱咏佳，陈海斌，许全珍，周燕，黎念，李晓英，黎甲元

（梧州市人民医院检验科儿科，广西 梧州）

0 引言

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）的感染率非常高，尤其在免疫力低下的人群中感染率尤为突出[1]。因此 ，在胎儿、婴幼儿、肿瘤放化疗、艾滋病及自身免疫性疾病等免疫功能不成熟和免疫功能低下个体缺乏反应能力中，HCMV 感染就会引发高发病率及病死率[2]。这就需要对HCMV 进行早期的准确诊断。为了探究血清、尿液、唾液在婴幼儿巨细胞病毒DNA 检测中的应用价值，本研究采取了实时荧光定量PCR 检测法，以探讨不同类型的标本在感染疾病诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019 年1 月至2019 年12 月在本院的儿科病区治疗，伴有不同程度的肝功能损害的患儿。留取患儿血清、尿液、唾液样本183 例，其中男性受检者132 例，女性受检者51例。年龄段在0d 至12 个月，平均年龄5 个月。

1.2 仪器与试剂

实时荧光定量PCR 扩增仪为AGS-4800。HCMV-DNA定量检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司HCMV 核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)。

1.3 方法

1.3.1 标本收集

（1）血液标本：采用含分离胶的干燥无菌真空采血管采集受检者静脉血2ml。

（2）尿液标本：留取受检者的尿液3ml，并将其放置在干燥无菌的试管中。

（3）唾液标本：留取受检者的唾液0.5ml，并将其放置在干燥无菌试管中。

以上标本取得后立即通过医院物流系统送至检验科检测。如不能立即检测，标本应在2℃-8℃冰箱保存。

1.3.2 标本处理

（1）血液标本：采取静脉血2ml，4000r/min 离心5min 分离血清，取100μl 血清加入100Ul DNA 浓缩液，混匀，4000r/min 离心5min，弃上清液，留取沉淀物，加入50μl DNA 提取液，混匀。100 ℃金属 浴孵育10min（误差＜1min），以12000r/min 的速率进行离心处理，时间为5min，并取病毒DNA 上清液2μl 用来做PCR 扩张。

（2）尿液标本：对标本进行混匀，并吸取3ml，将其放置在无菌离心管中，如尿液标本浑浊，应在37℃水浴箱浸泡10min 至尿液澄清。12000r/min 离心5min，弃上清液，留取沉淀物，加入50μl DNA 提取液，混匀。100 ℃金属浴孵育10min，以12000r/min 的速率进行离心处理，时间为5min，并取上病毒DNA 上清液2μl 用来做PCR 扩张。

（3）唾液标本：充分混匀后吸取0.5ml 于无菌离心管中，以12000r/min 的速率进行离心处理，时间为5min，弃上清液，留取沉淀物，加入50μl DNA 提取液，混匀。100℃金属浴孵育10min，以12000r/min 的速率进行离心处理，时间为5min，并取上病毒DNA 上清液2μl 用来做PCR 扩张。

1.3.3 标本检测

取HCMV PCR 反应管，分别加入处理后的标本DNA 模板2μl，瞬时离心。分别加入不同拷贝数的4 个浓度标准品（1.0×104，1.0×105，1.0×106，1.0×107）DNA 模板2μl，瞬时离心。将各反应管放入PCR 仪样品槽中。设置循环条件：93℃ 2min 预变性，然后按93℃ 45s，55℃ 60s 共10 个循环，最后按93℃ 30s，55℃ 45s，做30 个循环，于55℃ 45s 末收集荧光信号。同时做标准曲线，根据是阳性定量标准品的CT值，以CT 值来计算病毒DNA 的病毒载量。阳性的判定标准为DNA 拷贝数≥500 拷贝/ml，＜500 拷贝/ml 则为阴性。

1.4 统计学处理

使用SPSS 14.0 软件进行统计学分析，其中计量资料采用（±s）表示，并进行t 检验，计数资料采用（%）表示，并进行χ2检验，以P＜0.05 为差异学有统计学意义。

2 结果

183 例受检患儿血清标本HCMV-DNA 阳性率为2.19%；尿液标本HCMV-DNA 阳性率为28.42%；唾液标本HCMVDNA 阳性率为29.51%。尿液标本与血清标本差异有统计学意义（χ2=54.309,P＜0.05），唾液标本与血清标本差异有统计学意义（χ2=57.008,P＜0.05），尿液标本与唾液标本差异无统计学意义（χ2=0.053,P＞0.05）。见表1。47 例尿液和唾液同时阳性的病例，尿液样本HCMV-DNA 载量为（4.07±1.06），唾液样本HCMV-DNA 载量为（4.97±1.63），差异有统计学意义（t=-2.817，P＜0.05）。唾液样本中HCMV-DNA 载量明显高于尿液。

表1 183 例患儿血清、尿液和唾液HCMV-DNA 阳性率比较

3 讨论

婴幼儿巨细胞病毒性肝炎是一种常见的肝炎类型，其在婴幼儿发病中占有较大的比例[3,4]。一旦患病后会对患儿的肝功能造成损害，主要的临床表现为黄疸、肝脏肿大等，若不及时进行治疗将会对生命安全造成威胁。巨细胞病毒在感染人体后，其排出的途径主要为唾液、乳液、尿液及宫颈分泌物，且呈现出长期间歇性，通过口腔、产道、胎盘、哺乳、器官或骨髓移植等途径传播[5,6]。目前，检测HCMV 的常用方法有血清抗体检测、病毒抗原检测、病毒分离培养、荧光定量PCR 技术检测和尿液DNA 水平等[7,8]。选择合适的标本类型和检测方法，能准确而高效的检出巨细胞病毒，为诊断及治疗提供参考依据。

本研究结果显示，183 例婴幼儿受检者血清、尿液、唾液标本HCMV-DNA 的总阳性率分别为2.19%、28.42%、29.51%。尿液和唾液标本的HCMV-DNA 阳性率明显高于血清标本的HCMV-DNA 阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。在三类不同的标本类型中，唾液标本的HCMVDNA 载量明显高于尿液标本，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示不同类型的标本会对HCMV 的阳性率及病毒载量检测产生较大的影响。在婴幼儿群体中，血清HCMV-DNA 检出率低，且有采血较困难、血清样本溶血率较高等影响因素，因此，不推荐使用血清作为检测HCMV-DNA 的标本类型。采用唾液和尿液两种类型标本，能提高HCMV-DNA 检测的阳性率，唾液标本有容易获取、无创性等特点，且相对于尿液有更高一数量级的病毒载量，因此，唾液标本可作为尿液标本的有效补充，也可作为与尿液标本同时检测，以提高在拷贝数较低的标本中减少由于样本保存、提取、标准曲线等多种因素可能造成的漏检，提高检测阳性率，以协助临床做出早期诊断与治疗效果评价与监测。