蓝莓花青素干预肝硬化大鼠肝组织凋亡蛋白表达的变化*

汪 可，崔现平，刘丽娟，支庆江，姜文营

肝硬化是一种慢性或持久性肝损伤导致肝组织学改变的慢性疾病。随着病情不断发展会出现疲劳、黄疸、腹水等表现[1]。肝硬化的病因很多，我国主要由慢性乙型肝炎所导致[2，3]。此外，长期大量饮酒、肥胖、其他病毒感染也是造成肝硬化发生的病因[4-6]。随着社会的不断发展和饮食文化的变化，肥胖造成的脂肪肝进而发展为肝硬化的患者越来越多，目前已严重威胁国民尤其是青中年群体的身体健康。蓝莓花青素是从蓝莓中提取的一类天然色素，能够清除机体产生的氧自由基，达到抗衰老、抗氧化的功效，同时也能够预防和降低心血管疾病的发生[7，8]，也有报道认为蓝莓花青素还具有抗肿瘤作用[9]。本文主要研究蓝莓花青素对肝硬化大鼠氧化应激和肝纤维化的影响，为应用蓝莓花青素治疗肝硬化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器 SD大鼠30只，体质量210～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK(京)2017-0022。蓝莓花青素购于江西泰诚天然香料有限公司，二乙基亚硝胺购于美国Sigma公司。丙二酸(MDA)试剂盒、Masson染色试剂盒购于美国Bio-Red公司；检测超氧化物酶(SOD)试剂盒购于南京建成生物公司；检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(Alb)试剂盒购于美国Cayman公司；检测TNF-α和TGF-β1的ELISA试剂盒购于美国Invitrogen公司。兔抗鼠Bcl-2、抗Bad、抗c-caspase-3、抗β-actin多克隆抗体和蛋白酶抑制剂等购于美国Santa Cruz公司；HRP标记的羊抗兔IgG和HRP标记的羊抗鼠IgG购于美国Thermo公司；细胞裂解液、ECL化学发光试剂和其他耗材购于上海生工生物有限公司。DNM-9606酶标仪购于北京朗普新技术有限公司；荧光显微镜购于日本Olympus；湿转仪购于美国AB公司；电泳仪购于美国Bio-Red公司；凝胶成像系统购于以色列DNR公司；其他仪器购于德国Eppendorf公司。

1.2 肝硬化大鼠模型的构建与处理 将30只大鼠随机分为对照组、模型组和实验组。给予对照组大鼠生理盐水10 ml.kg-1灌胃，1次/d；给予模型组和实验组大鼠二乙基亚硝胺 75 mg.kg-1腹腔注射，1次/d，同时给予模型组生理盐水10 ml.kg-1灌胃，给予实验组大鼠蓝莓花青素溶液50 mg.kg-1灌胃，各组大鼠均处理8 w。在实验结束时，经框下窦取血，离心后取血清。取肝组织0.1 g，加入9倍4℃生理盐水，制备10%肝组织匀浆。取100 μl上清液，加入Buffer，100℃水浴15 min，自然冷却，3000 r/m离心10 min，取上清置于比色杯，以蒸馏水为参照，测定532 nm波长下的OD值。按试剂盒说明，计算血清MDA和SOD含量。取肝组织，用石蜡包埋、切片，行HE和Masson染色，用乙醇和二甲苯透明，中性树脂封片，在光镜下观察。

1.3 肝组织c-caspase-3、Bax和Bcl2蛋白表达检测 采用Western blot法检测，取肝组织，用剪刀剪成小块，提取组织总蛋白，在酶标仪490 nm波长下行蛋白定量。用12% SDS-PAGE电泳分离，采用湿转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，在4℃条件下依次加入封闭液孵育2 h，加兔抗鼠Bcl-2、抗Bad、抗c-caspase-3、抗β-actin (稀释比例均为1:1 000) ，孵育过夜。加二抗(稀释比例均为1:5 000)，孵育2 h。以β-actin为内参蛋白，采用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统检测分析蛋白条带，应用Image J对蛋白质条带进行定量分析。

2 结果

2.1 各组肝组织病理学表现 对照组大鼠肝组织细胞排列紧密有序，模型组肝组织出现明显的组织纤维化，实验组肝组织也出现组织纤维化，但与模型组相比，肝组织纤维化和炎性损伤明显得到改善(图1)。

2.2 各组血生化和细胞因子水平比较 蓝莓花青素处理组动物血清ALT和AST及TNF-α和TGF-β水平显著低于，而血清白蛋白水平显著高于模型组(P<0.05，表1)。

图1 各组大鼠肝组织病理学表现A：对照组(HE，100×)；B：模型组(Masson，400×)；C：蓝莓花青素处理组(Masson，400×)

ALT(U/L)AST(U/L)白蛋白(g/L)TNF-α(ng/L)TGF-β(ng/L)对照组102.47±5.25104.45±3.8737.68±3.080.81±0.050.92±0.07模型组579.87±20.37①428.58±18.25①30.69±2.58①2.56±0.18①2.12±0.15①实验组371.89±14.72①②148.71±6.34①②34.71±3.34①②1.73±0.11①②1.45±0.12①②

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05

2.3 各组肝组织MDA和SOD水平比较 肝硬化大鼠肝组织MDA水平显著高于，而SOD活性显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 各组肝组织匀浆MDA和SOD水平比较

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05

2.4 各组肝组织Bcl-2、Bad和c-caspase-3蛋白表达水平比较 肝硬化大鼠肝组织Bcl-2蛋白表达水平显著降低，而Bad和c-caspase-3蛋白表达水平显著升高，经蓝莓花青素处理动物肝组织Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bad和c-caspase-3蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学有意义(P<0.05，表3)。

表3 各组肝组织凋亡蛋白表达水平比较

与对照组比，①P<0.05；与模型组比，②P<0.05

3 讨论

肝硬化是由于各种慢性或持久性的肝脏损伤导致肝脏不能正常发挥功能的慢性疾病，随着病情不断发展会出现疲劳、黄疸、腹水等症状和体征，肝组织病理学检查会发现肝硬化患者的肝组织出现大量结节再生和纤维化伴有肝细胞坏死[10]。患者早期无明显的指标异常，随着病情不断发展会出现丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶等指标升高，发展到晚期则会出现脾功能亢进症等其他组织器官的损伤[11]。目前，肝硬化的发病机制比较统一的认识是认为由于肝组织成纤维细胞和星状细胞的增殖和迁移，炎症反应引起的氧化应激及肝脏细胞的自身凋亡等，从而诱发了机体的免疫反应以清除病毒感染，造成肝组织损伤，而在酒精性肝病和脂肪性肝病，各有其不同的发病机制[12，13]。

近年来，通过日常饮食和果蔬成分的营养调节治疗慢性疾病已成为大多数人群的首选模式，蓝莓花青素是从蓝莓中提取的一类天然色素，对人体的健康有重要的意义，能够清除机体产生的氧自由基，达到抗衰老和抗氧化的功效，同时也能够预防和降低心血管疾病的发生。也有研究报道认为蓝莓花青素还具有抗肿瘤的作用[14-17]。体外研究还发现蓝莓花青素对乙型肝炎病毒具有一定的抑制作用[18]，因此蓝莓花青素是一种潜在的能改善患者肝硬化的有效药物成分。本文通过构建肝硬化大鼠模型，研究了蓝莓花青素对大鼠肝硬化相关指标的影响，结果表明蓝莓花青素能够减轻模型大鼠肝组织纤维化和纤维结节。与模型组相比，经蓝莓花青素处理的大鼠血清ALT和AST水平明显降低(P<0.05)。同时，能影响肝脏纤维化的进展的TNF-α和TGF-β1也明显降低。在抗氧化应激方面，与对照组相比，模型组大鼠肝组织匀浆MDA含量显著增加，而SOD含量明显降低(P<0.05)，经蓝莓花青素处理后大鼠肝组织匀浆MDA含量显著降低，而SOD含量明显回升(P<0.05)。一般认为，肝硬化的发生发展与肝细胞凋亡有一定的关系。我们采用Western blot法检测发现，模型组肝组织抑制凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低，而Bad和c-caspase-3表达显著增强。Bcl-2家族蛋白和caspase-3蛋白是调控细胞凋亡的主要蛋白[19，20]，研究表明我们构建的肝硬化大鼠肝组织确实存在细胞凋亡现象。经过蓝莓花青素处理动物肝组织Bcl-2蛋白表达显著提升，而促凋亡蛋白Bad和cleaved-caspase-3的表达明显受到抑制(P<0.05)。

综上所述，蓝莓花青素可能具有肝细胞保护作用，其机制可能与其能够下调TNF-α和TGF-β1表达，抑制肝纤维化，降低肝组织氧化应激反应，抑制肝细胞凋亡，这些作用的发挥可能与调节了凋亡蛋白的表达有关。蓝莓花青素是一种植物成分，其中起作用的成分复杂，需要精细处理和纯化，分离出不同的组分，才能深入研究其有效成分。