花青素合成转录因子PAP2植物表达载体构建及其遗传转化

段真珍　黄振　周宇明　李慧雪　涂万富　张木清　姚伟

摘要 AtPAP2基因是拟南芥花青素生物合成途径中的重要调控基因，为了实现该基因在烟草中的高效表达，从拟南芥中分离克隆出了AtPAP2基因并构建了植物表达载体，利用农杆菌介导的侵染方法，将该基因成功转入到烟草受体材料中，并获得了紫色的转基因烟草植株，相对于野生型烟草，该烟草在根、茎、叶等组织上均表现出不同程度的紫色。进一步的qRT-PCR分析结果表明，在花青素生物合成途径中，AtPAP2基因的表达可以上调从4-香豆酰CoA到最终合成花青素过程中的相关基因，促进了合成反应的进行，对花青素的合成具有重要的作用。该研究对于揭示AtPAP2基因的作用以及烟草花青素合成途径相关基因的调节机理具有重要的意义。

关键词 烟草;花青素;转录因子;转基因

中图分类号 Q943.2文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）13-0106-05

Abstract The AtPAP2 gene is a regulatory gene in the anthocyanin synthesis pathway of Arabidopsis thaliana，in order to express this gene in tobacco， we successfully cloned the AtPAP2 gene from A. thaliana and constructed into a plant expression vector. We successfully transferred this gene into tobacco by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation， and achieved the purple phenotype transgenice tobacco plants.Compared with the wild type tobacco plant， the transgenic tobacco plants showed different degree of purple color in root，stem and leaf. qRTPCR analysis showed that the expression of AtPAP2 gene in tobacco significantly upregulated the related genes from 4coumaroylCoA to anthocyanins， and promoted the synthesis of anthocyanins. This research is of great significance to reveal the role of AtPAP2 gene and reveals the regulation mechanism of anthocyanin biosynthesis pathwayrelated genes in tobacco.

Key words Tobacco;Anthocyanin;Transcription factor;Transgenic plant

花青素是一类在植物中广泛存在的次级代谢产物，属于黄酮类物质[1-2]。在自然界中花青素赋予了花草、树木多彩缤纷的颜色，有助于其吸引各种昆虫媒介进行授粉、种子传播[3]，同时，花青素在植物抵抗各种逆境胁迫等方面也具有较为重要的作用。现代医学研究表明，花青素在治疗心脏病和癌症，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要疗效[4]，因而关于花青素的研究也越来越受人们的重视。

目前，花青素生物合成途径已经在模式植物中研究得较为清楚，苯丙氨酸是花青素合成的直接前体物质[1]，在不同基因的调控下，经过一系列的酶促反应最终合成各式各样的花青素。花青素在植物体内的合成主要受到两类基因的调控，一类是结构基因，可以编码合成各种酶类，另一类是调节因子，调控结构基因的合成[5]。目前，花青素合成相关的主要的酶及其编码基因在一些植物中已被成功分离和鉴定，如拟南芥、玉米、金鱼草、苹果、矮牵牛等。调控结构基因转录的调节因子在很多植物中也被成功分离和鉴定[6]，这些调节因子主要包含3个基因家族，R2R3 MYB家族、bHLH家族和WD40家族[7-8]。这些调节因子主要是调节结构基因在特定时间和空间的表达，调节各类次级代谢产物的发生，对植物生理生长具有重要的意义。

异位表达是研究花青素调节因子在植物花青素合成过程中所行使的具体功能的一個方法。烟草是一种常用的模式生物，在烟草中转入相应的花青素合成的调节因子进行异位表达，可提高叶、花或种子中花青素的含量，获得可视的植物表型。AtPAP2 基因[9]是R2R3 MYB家族中的一员，最早发现于拟南芥中，该基因具有一个完整的开放阅读框，可编码249个氨基酸。该研究拟从拟南芥中分离克隆AtPAP2基因并构建高效的植物表达载体，通过农杆菌介导法将AtPAP2基因转入到烟草中，培养获得紫色的烟草，并利用qRT-PCR检测转AtPAP2基因烟草中花青素合成相关基因的表达量变化，初步解析AtPAP2基因在花青素合成中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用野生型烟草（Nicotiana tabacum cv.xanthinc）无菌苗、野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana Col-0）幼苗、大肠杆菌菌株（DH5α）和农杆菌菌株（EHA105）均由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存，植物表达载体pGNP由美国康涅狄格大学植物学系惠赠。

RNAprep Pure Plant Kit和植物基因组DNA提取试剂盒购自美国Qiagen生物公司;Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和2×Taq PCR Mix均购自美国Roche生物公司;pMD18-T simple载体和SYBR Premix Ex TaqTM购自大连宝生物公司;质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收纯化试剂盒购自美国Qiagen生物公司;T4 DNA连接酶购自美国Promega公司;Murashige & Skoog（MS）Basal Medium w/ Vitamins购自PhytoTechnology公司;其他试验所用试剂均为进口或国产分析纯。基因序列测定和相关引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成。

烟草遗传转化所采用的预培养培养基：MS+ 6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;分化培养基（含抗生素）：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+Kan 75 mg/L+Timentin 150 mg/L;生根培养基：MS基本培养基;悬浮培养基：液体MS培养基;以上培养基均含有蔗糖30 g/L，琼脂0.7 g/L（悬浮培养基除外），pH 5.8～6.0，培养温度为（25±1）℃，除暗培养步骤外，烟草遗传转化过程中其他步骤均在光照下（12 h/d）培养，光照强度1 000～2 000 lx。

1.2 拟南芥叶片总RNA提取和AtPAP2基因的克隆

根据GenBank公布的拟南芥AtPAP2基因（登录号为AF325124）序列信息，在开放阅读框两侧设计一对特异性扩增引物，命名为pPAP2-F/R，用以扩增目的基因片段（表1）。

参照美国Qiagen生物公司的RNA提取试剂盒说明书，提取长势良好的拟南芥叶片组织的总RNA，用NanoDrop 2000测定RNA的浓度与纯度。取1 μg RNA为模板，采用美国Roche生物公司的反转录试剂盒进行反转录合成第一链cDNA。以拟南芥cDNA为模板，利用pPAP2-F/R引物进行PCR扩增获取目的基因。PCR反应体系为cDNA 1.0 μL、dNTP 2.0 μL、2×Taq PCR Mix 10.0 μL、pPAP2-F（10 mmol/L）05 μL、pPAP2-R（10 mmol/L）0.5 μL，用ddH2O补足至20 μL。反应条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环;最后72 ℃延伸10 min。反应结束后取1.0 μL产物用1%琼脂糖凝胶检测。同时，利用DNA胶回收试剂盒切胶回收并纯化目的条带，连接至pMD18-T载体中，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上培养，获得单克隆进行PCR检测，将阳性克隆送去南京金斯瑞生物公司进行测序验证，命名为pMD18-PAP2。

1.3 植物表达载体的构建及其遗传转化农杆菌

参考美国Qiagen生物公司的质粒DNA提取试剂盒说明提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA，用限制性内切酶BstXI和KpnI进行双酶切反应。利用胶回收纯化试剂盒分别纯化相应的质粒酶切产物，并在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至100 mg/L卡那霉素的LB平板上，置于37 ℃培养箱中培养12 h。挑取单克隆并利用菌液PCR进行验证后，将阳性转化子送南京金斯瑞生物公司进行测序。选择经测序验证序列正确的菌液保存并提取重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2，利用液氮冻融法将该质粒转入到农杆菌EHA105感受态细胞，随机挑取单克隆利用PCR进行验证，扩增引物pPAP2-F和pPAP2-R序列见表1。

1.4 烟草遗传转化及转基因植株的筛选鉴定

剪取数十片无菌烟草组培苗叶片，用刀片切成0.5 cm×0.5 cm小叶片，置于预培养基上暗培养3 d。取含有pGNP-PAP2的EHA105农杆菌划线接种至LB固体培养基（Kan 100 mg/L），28 ℃培养过夜后挑取单菌落并接种到50 mL的LB液体培养基中（Kan 100 mg/L），28 ℃下振荡培养12～16 h至OD600约为0.5，经扩大培养4～6 h至OD600约为0.6后低速离心弃上清，用等体积的悬浮培养基重悬菌体。将预培养的叶片置于重悬菌液10～15 min后取出，接种至分化培养基上进行培养，直至长出愈伤并分化出丛生芽，将丛生芽剪下转接至生根培养基上继续培养，直至长成完整的植株。利用植物基因组DNA提取试剂盒提取转基因烟草小苗叶片总DNA，以pPAP2-F和pPAP2-R为引物进行PCR检测，验证AtPAP2基因是否整合到烟草基因组DNA上。

1.5 qRT-PCR分析花青素合成相关基因的表达差异

烟草的花青素是以苯丙氨酸为前体物质，经过一系列酶促反应而合成的，其间受到编码各类酶合成结构基因的调控（图1）[10]。该试验从中选取7个基因，设计合成qRT-PCR的引物（表1），内参基因选取Elongation factor 1α（EF-1α），GenBank序列号为AF120093。参照“1.2”中植物叶片总RNA提取方法，分别提取紫色转基因烟草和野生型烟草的RNA，反转录合成得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，通过与野生型烟草比较，分析转AtPAP2基因紫色烟草中7个基因表达量的变化情况。

2 结果与分析

2.1 擬南芥叶片总RNA提取和AtPAP2基因的克隆

利用RNA提取试剂盒从拟南芥的叶片中提取总RNA（图2A），以表1中pPAP2-F和pPAP2-R为特异性引物，拟南芥总RNA反转录获得的cDNA为模板，通过PCR扩增获得了AtPAP2基因，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，获得的目的基因条带约为750 bp，与预期AtPAP2基因大小一致（图2B）。将目的条带进行切胶回收纯化后，连接至T/A克隆载体pMD18-T，然后转化至大肠杆菌DH5α。随机挑取单克隆进行菌落PCR验证后，对阳性克隆继续测序验证，将测序结果通过SnapGene Viewer生物学软件进行分析，结果表明克隆的目的片段大小为750 bp，与GenBank中AtPAP2基因序列完全一致，含有AtPAP2完整的编码序列，命名为pMD18T-PAP2，可用于下一步的植物表达载体构建。

2.2 植物表达载体的构建及其转化至农杆菌

根据图3所示的植物表达载体图谱进行载体构建。先提取pMD18T-PAP2菌液的质粒DNA，与植物表达载体pGNP的质粒DNA同时用限制性内切酶BstXI和KpnI进行酶切，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测并分别切胶纯化回收AtPAP2目的片段和pGNP载体的大片段（图4）。利用T4 DNA连接酶进行连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含有卡那霉素抗性的筛选培养基上培养。

随机挑取单菌落进行菌落PCR验证，筛选出的阳性克隆命名为pGNP-PAP2。利用液氮冻融法将该质粒转化到农杆菌 EHA105感受态细胞中，挑取单菌落进行菌落PCR检测（图5），将检测为阳性的菌液送往公司测序，结果表明AtPAP2基因已经完整构建至植物表达载体，并成功转化至农杆菌EHA105中，可以用于下一步植物受体材料的遗传转化。

2.3 转基因烟草植株的获得及其表型观察

用含有pGN-PAP2的农杆菌EHA105侵染烟草叶片，置于含有抗生素的培养基上培养约15 d，可以看到叶片周围有紫色的抗性愈伤组织出现，继续培养10～15 d即可分化出紫色的丛生芽。待紫色抗性丛生芽长出叶片，将其接种至含抗生素的生根培养基上继续培养，5～7 d开始生根，继续培养20 d左右烟草幼苗可长至5～10 cm高，可将其移栽至土壤中。提取紫色抗性转基因烟草植株的基因组DNA，利用表1中特异性引物pPAP2-F和pPAP2-R对其进行PCR检测，结果显示表现为紫色的抗性烟草苗均能够扩增出750 bp的AtPAP2基因序列（图6），证实了该外源基因已经整合进入烟草基因组。

通过培养观察发现，相对于野生型烟草，紫色的转基因烟草仅在植株叶片、茎和根等器官的颜色上存在差异，在其生长速度、生长状态及开花结实特性等方面均表现为完全一致，进一步表明AtPAP2基因在转基因烟草中可以过量表达，从而使转基因烟草呈现出紫色（图7 A～G）。

2.4 AtPAP2對烟草花青素合成相关基因的影响

作为植物类黄酮合成途径的一个分支途径，花青素的生物合成已经在模式植物中进行了较多研究。研究结果表明花青素合成的前体物质是苯丙氨酸，在一系列基因的调控下，苯丙氨酸经过一系列酶促反应最终形成花青素。为了研究拟南芥

AtPAP2基因在烟草植株中的表达情况，该研究提取了转基因烟草叶片的总RNA，利用实时荧光定量PCR方法，对选取的花青素合成通路上的7个基因进行检测，用于分析转基因烟草植株中AtPAP2基因的表达对花青素合成通路的影响[11]。qRT-PCR结果表明，在花青素合成的前期，即从苯丙氨酸到4-香豆酰CoA的过程中，AtPAP2基因影响作用并不明显，只是有限上调了NtPAL基因和有限下调了Nt4CL基因的表达。但是在从4-香豆酰CoA到花青素合成的过程中，转AtPAP2基因植株中的NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtDFR、NtANS基因表

现出了明显的上调表达，与野生型的表达量差异达到数十倍，极大地促进了该过程一系列的酶促反应，大大提高了植株中花青素的表达量（图8）。

3 讨论

花青素因其良好的医疗保健功效而受到越来越多人的青睐，但是目前食品工业所用的色素多为工业合成，具有不同程度的毒性，长期食用反而有害健康，因此研究开发和利用天然色素已经成为一种趋势。AtPAP2基因在烟草中的过量表达能够显著提高从4-香豆酰CoA到花青素生物合成过程中相关基因的表达，可以大大提高花青素的含量且不影响植株的正常生长。由于烟草易于种植且生物量大，转AtPAP2基因的紫色烟草不失为一种提取天然色素的好材料。

近年来，越来越多的花青素合成调节基因被克隆出来，并被证明能在其他物种中诱导花青素的合成[12]。王霜等[13]通过分析苦荞花期转录组数据，筛选克隆了一个黄酮代谢相关的MYB类转录因子FtMYB23。转基因过表达的拟南芥种皮颜色均呈现出比野生型更深的褐色;杨捷等[14]从东方百合中克隆花青素生物合成转录因子Lhsor MYB12基因。基因表达分析结果表明该基因在花蕾发育过程中表达量逐渐增高，并在花蕾盛开时达到最大值;连文力等[15]通过烟草腺毛特意表达启动子，构建AtPAP1表达载体，获得了腺毛的腺头呈红色的烟草;Zou等[16]从玫瑰中克隆获得了花青素合成的转录因子RrMYB6，研究分析表明该基因在雄蕊中表达最高，在花瓣中表达最低;Nakatsuka等[17]在烟草中过表达龙胆根MYB1R转录因子，减少了烟草花朵中花青素的积累。Huang等[4]将杨梅中与花青素合成相关的MrMYB1基因分别导入到烟草和拟南芥中，提高了拟南芥各个组织中花青素的含量，也提高了烟草除叶片外其他组织中花青素的含量。该研究通过在烟草中异位表达AtPAP2基因，也同样获得了紫色表型的转基因烟草，并且经过初步观察表明，相对于正常的烟草，紫色烟草在生长速度、生长状况和开花结实等特性方面均没有明显差异。该研究还证实了可以通过在植物中导入外源花青素合成调节基因，调节体内花青素生物合成相关基因的表达，从而影响花青素积累，改变植物颜色，为培育新的色彩各异观赏植物提供了一种新思路。

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