重庆卷丹病毒检测与脱毒方法研究

符勇耀,杨利平,高海洪,徐文姬,雷美艳,王安祥

(1.长江师范学院 现代农业与生物工程学院，重庆 408100； 2重庆市药物种植研究所，重庆 408435)

卷丹(LiliumlancifoliumThunb.，2n=3x=36)又名宜兴百合、虎皮百合，是百合属(LiliumL.)多年生球根类植物，在中国分布范围极广[1]。作为自然存在的三倍体，卷丹不仅食药用价值高，还是重要的花卉之一，深受广大消费者喜爱。湖南龙山、江苏宜兴和安徽霍山是中国卷丹的主产区[1-2]。在重庆地区海拔1000m左右山地生长广泛，具有独特的地理和气候条件，近年来，在重庆南川、黔江和秀山等区县大面积引种湖南卷丹，种植面积已达0.16万hm2，年产量约3万t，初步形成产业规模。然而，卷丹在栽培过程中多采用无性繁殖，造成病毒不断累积，使植株发生病毒病，严重危害其产量和品质。目前已报道侵染百合的病毒达19种以上，其中最主要的病毒为百合斑驳病毒(Lilymottlevirus, LMoV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)和百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus, LSV)[3-4]等。这3种病毒通常以其中2种或3种同时侵染百合植株，给百合生产造成严重问题[5-7]。利用化学药剂或生物制剂难以对病毒病进行有效防治，直接利用百合脱毒苗已成为控制病毒病的重要措施[4, 8-9]。因此，建立一种针对卷丹的脱毒快繁技术，对其产业发展具有重要意义。

目前百合脱毒技术主要以百合微茎尖培养为主，并结合其他处理方式。王超等[10]通过对5种百合脱毒研究发现，即使以0.3～0.5mm 最适脱毒长度的茎尖进行培养，CMV脱毒率不足65%，而LSV不足50%，且成活率为57.62%。高慧卿等[11]将百合组培苗65℃高温预处理30min后，剥取0.2～0.5mm茎尖进行脱毒培养，CMV和LSV的脱毒率分别为46.88%和74.65%，但平均成活率不到60%。孙明伟等[12]研究发现剥取0.4～0.7mm茎尖进行培养，脱毒率为61%，存活率达76%。周晓波等[13]将卷丹珠芽置于38℃高温条件处理20d后，剥取0.4～0.6mm茎尖，接种在添加5～10mg/L病毒唑的芽诱导培养基中，脱毒率可达90%，但成活率仅为60%左右。上述方法中剥离的茎尖均小于0.8mm，茎尖不易剥取，需要借助解剖镜等仪器设备，操作复杂，易污染且再生率低。

病毒易于通过维管系统移动，而茎尖维管系统尚未发育完善，通常剥取茎尖越小，其脱毒率越高，但成苗率越低；反之，其成活率虽然提高，但脱毒率较低。因此，克服两者的矛盾，便可以打破百合脱毒生产的瓶颈，如此既提高茎尖再生率，又提高脱毒率。本研究以含病毒的湖南卷丹珠芽为材料，通过高低温交替处理结合2次茎尖培养 (1.0～1.5mm)，运用RT-PCR方法对脱毒效果进行检测，构建一种操作简便、高效的卷丹脱毒快繁方法。研究结果将促进百合脱毒育苗工作的推广应用，为重庆地区卷丹产业发展提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为优质卷丹种球，引自湖南郴州。种植于重庆市南川区三泉镇，采集种植2 a后的卷丹珠芽备用。

1.2 脱毒试验方法

1.2.1 病毒引物设计 百合常见病毒CMV、LMoV、LSV和百合X病毒(Lily virus X，LVX)检测引物参照陈进等[14]的引物序列。引物由华大基因重庆分公司合成。

1.2.2 病毒PCR检测 以引种2 a后发生分球的卷丹珠芽或经过脱毒的组培苗为材料，利用植物RNA小量提取试剂盒(R4151, TIANGEN)提取总RNA，经过电泳检测，采用植物cDNA快速反转录试剂盒(KR116, TIANGEN)合成第一链cDNA。反转录反应包括总RNA 2 μg，5×g DNA Buffer 2 μL，RNase-Free ddH2O 补至10 μL，42 ℃孵育5 min，冰上放置；然后添加10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O 5 μL，反应程序为42 ℃孵育30 min， 70 ℃灭活5 min。PCR反应选用大连宝生物公司产品(RR001, TAKARA)，PCR反应总体积为20 μL，包括：第一链cDNA 1 μL，10×Buffer(含20 mmol/L Mg2+)2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.2 μL，13.8 μL ddH2O。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38个循环； 72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。取5 μL PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，利用BioRad凝胶成像仪分析结果。

1.2.3 高低温交替处理 以病毒检测阳性的卷丹珠芽为材料，在自来水下冲洗珠芽表面污垢，用洗衣粉泡10 min，并冲洗1～2 h，晾干。将处理好的珠芽置于4 ℃低温处理3～4 d，之后再置于38 ℃高温处理3～4 d，如此交替处理持续24～ 32 d。期间光照度为6 000～ 7 000 lx，光照时间为12 h/d，喷洒38 ℃无菌水保持珠芽湿度。

1.2.4 第一次茎尖培养 将经过高低温交替处理的珠芽剥去最外层，用洗衣粉泡10 min，并在流水下冲洗1～2 h，置于无菌操作台紫外照射15 min，用75%乙醇浸泡40 s，0.2%升汞溶液处理12 min，再用无菌水冲洗3～5遍。用灭菌滤纸吸干水分，利用解剖刀、镊子和解剖针剥取1 mm左右(<1.5 mm)的茎尖，以1瓶1颗的规格接种于MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10 mg/L病毒唑的固体培养基(不含蔗糖)中暗培养7 d，然后转入温度为(25±2) ℃，光照度6 000～ 7 000 lx，12 h/d光照环境培养60 d，随机选取50个样本进行病毒检测并统计结果。

1.2.5 第二次茎尖培养 将经过1次茎尖培养诱导的不定芽继续剥取1 mm左右(<1.5 mm)茎尖，以1瓶3颗的规格接种于固体MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10 mg/L病毒 唑+30 g/L蔗糖的培养基暗培养7 d，然后转入(25±2) ℃、光照度6 000～7 000 lx和12 h/d光照环境中继续培养60 d。随机选取50个样本进行脱毒检测，并统计结果。

1.3 脱毒苗快繁方法

1.3.1 鳞片不同部位的芽分化培养基筛选 将脱毒苗外层鳞片横切为上下两部分，将上部分、下部分和整块鳞片分别接种于含不同质量浓度 6-BA(0.5、1、1.5、2 mg/L)和NAA(0.05、0.2 mg/L)配比的MS基本培养基中，每瓶放3个，每个质量浓度梯度接种10瓶。培养条件为温度 (25±2) ℃，湿度60%～70%环境下暗培养7 d，转至光照度6 000～7 000 lx，光照时间12～14 h/d的环境中培养45～60 d。统计鳞片不同部位的出芽总数、出芽率和出芽系数等。

1.3.2 增殖培养基筛选及生根培养 将诱导出的不定芽接种到含0.3 mg/L NAA和不同质量浓度6-BA(0.5、1.5、2.5 mg/L)的MS或1/2MS培养基，每瓶培养基放5个，每个质量浓度梯度接种10瓶。培养条件为温度(25±2) ℃、湿度 60%～70%，光照度为6 000～7 000 lx、12～14 h/d。培养60 d后统计不定芽总数和增殖系数。将不定芽接种于含不同蔗糖质量浓度(0～100 g/L)的MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基培养，直至生根，统计生根情况。

1.4 数据统计分析

使用Excel 2013和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。采用Duncan’s法进行差异显著性检验 (P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 珠芽获取与含病毒检测

从湖南郴州引种的卷丹在重庆南川区种植 2 a后种球发生明显退化，表现为3～6个球的分球现象，同时地上部分植株表现出病毒症状，如花瓣扭曲，子房和花柱畸形等(图1)。收集退化植株珠芽材料，以正常卷丹珠芽为对照，通过反转录RT-PCR对百合病毒CMV、LSV、LMoV和LVX进行检测。结果(表1)表明，正常卷丹珠芽中未检出百合病毒，而退化珠芽中主要含LSV和LMoV病毒，其中LSV检出率为66.7%，LMoV检出率为46.2%，混合带毒率为46.2%，未检出CMV和LVX病毒。说明重庆南川区引种卷丹主要感染病毒为LSV和LMoV病毒。

A.正常卷丹花部形态;B.退化卷丹花部畸形

表1 卷丹珠芽病毒检出率Table 1 Detection rate of virus in bulbils of L.lancifolium

2.2 一次茎尖培养脱毒效果

将卷丹珠芽通过紫外灭菌和表面消毒剂处理后，剥取1 mm左右(<1.5 mm)茎尖生长点接种于含病毒唑的芽分化培养基，15 d后发现，茎尖开始膨大变绿，30 d后茎尖开始生成小苗。统计结果表明(表2)，1 mm左右(<1.5 mm)珠芽茎尖生长点成苗率平均为90.28%。随机选取50个脱毒幼苗，通过RT-PCR分析表明(图2-A和图2-B)，LSV和LMoV病毒均被部分脱除，LSV脱毒率为52%，而LMoV脱毒率为44%(表3)。综上所述，剥取1 mm左右(<1.5 mm)茎尖培养，虽然成苗率较高但脱毒效果较差。1次茎尖培养脱毒苗需再次脱毒，以达到较为理想的脱毒效果。

表2 1.0～1.5 mm茎尖成苗率Table 2 Survival rate of 1.0-1.5 mm shoot tip

A.第一次茎尖培养后LSV脱毒验证电泳图。M.DNA 分子标记; 1～12.LSV验证结果;B.第1次茎尖培养后LMoV脱毒验证电泳图。M.DNA 分子标记; 1～12.LMoV验证结果；C.第二次茎尖培养后LSV脱毒验证电泳图。M.DNA 分子标记; 1～12.LSV验证结果。D.第二次茎尖培养后LMoV脱毒验证电泳图。M.DNA 分子标记; 1～12.LMoV验证结果

表3 茎尖培养脱毒率Table 3 Detoxification rate of shoot tip culture

2.3 2次茎尖培养脱毒效果

以1次茎尖培养60 d幼苗为材料，继续剥取1 mm左右(<1.5 mm)茎尖生长点接种于含病毒唑的芽分化培养基，培养直至获得脱毒幼苗。结果表明(表2)，1 mm左右(<1.5 mm)小鳞茎茎尖继代的成苗率平均为90.68%，且污染幼苗数明显低于第一次珠芽茎尖污染幼苗数。随机选取50个脱毒幼苗，通过RT-PCR分析表明(图2-C和图2-D)，LSV病毒和LMoV病毒绝大部分已被脱除。统计结果显示(表3)，LSV脱毒率为88%，而LMoV脱毒率为86%，相比第一次茎尖脱毒培养，脱毒效果提高了将近1倍。

2.4 脱毒苗的组培快繁

2.4.1 不定芽诱导培养 将经过2次茎尖脱毒培养的外层小鳞片，用刀片从1/2处将其分为上、下两部分，转接到含不同激素浓度配比的芽分化培养基中，45 d时统计各处理丛生芽生长情况(图3)。结果表明(表4)，不同激素含量对外层鳞片上部的诱导有显著差异，其中A2、A5的诱导率为24.45%和23.33%，而A4、A6均超过40%，A6诱导率最高，达47.78%。A4诱导的不定芽最多，诱导系数为2.88。激素对下部外层鳞片的诱导结果显示(表5)，A6的芽诱导率最高，达到91.11%，而A1芽诱导率最低，为64.45%。诱导效果最好为A4，不仅诱导率达85.56%，且诱导系数为最高，为6.35。与上部分鳞片诱导结果相比，下部分鳞片诱导效果明显更优。激素对整瓣鳞片不定芽诱导结果如表6，诱导效果最佳的仍是A4，不定芽诱导率为87.78%，诱导系数为 3.70；较差为A2和A6配比，A2的芽诱导率最低，为57.78%，而A6的芽诱导系数最低，为 1.95。因此，下部鳞片受激素诱导不定芽效果最佳，其次是整瓣鳞片，最差为上部鳞片。

2.4.2 增殖继代培养及生根诱导 将外层鳞片诱导的丛生芽，切分成单个芽体，转接到不同培养基中继代培养，培养15 d后开始出现分化小芽，30 d分化的小芽鳞片逐渐增多、增大，分化芽的数量也增多(图3-g)，其中B4、B5、B6在培养30 d

a-d: 一次茎尖脱毒培养.a.高低温交替处理后的珠芽; b.1.0～1.5 mm茎尖培养; c.培养30 d茎尖; d.培养60 d茎尖.e-f: 鳞片的快繁体系.e.下部鳞片诱导培养; f.45～60 d丛生不定芽; g.不定芽增值继代30 d; h.生根培养45 d

表4 激素对上部鳞片不定芽的诱导Table 4 Induction of adventitious buds in upper part of scales by phytohormones

表5 激素对下部鳞片不定芽的诱导Table 5 Induction of adventitious buds in lower part of scales by phytohormones

表6 激素对整瓣鳞片不定芽的诱导Table 6 Induction of adventitious buds in whole scales by phytohormones

时已出根。结果显示(表7)，B1、B2、B3增殖效果明显优于B4、B5、B6，说明1/2MS培养基不利于芽增殖分化，但能促进根提前形成。在NAA浓度一致时，高质量浓度6-BA促进不定芽增殖，其中B3(MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 2.5 mg/L+蔗糖30 g/L)增值倍数最大，增殖系数为3.39。将增殖无菌苗鳞片接种到含不同蔗糖浓度的生根培养基，结果表明(表8)，在C3(含50 g/L蔗糖)中效果最优，培养20 d开始出现生根，45 d后生根率达到98.72%(图3-h)。

3 讨 论

卷丹是重庆地区百合主栽品种，种植卷丹已成为不少区县脱贫致富的重要经济手段。由于卷丹栽培方式多为无性自繁且技术含量不高，使引种的优良种球在种植2～3 a后发生明显退化现象。研究表明，病毒病是影响卷丹生产的瓶颈问题[13,15-17]。为促进重庆地区扶贫和卷丹产业发展，课题组于2015年和2016年先后从湖南引进优良的卷丹种球进行栽培。通过RT-PCR分析表明，在重庆南川区引种的卷丹主要感染LSV和LMoV，导致其鳞茎和花部品质下降。前人研究发现CMV、LMoV和LSV 3种病毒往往以其中2种或2种以上同时侵染百合，并且以CMV和LSV或者LMoV和LSV为常见[18-20]，本研究发现与后者相似。对退化卷丹的病毒检测分析表明，LSV病毒的检出率(66.7%)明显高于LMoV病毒(46.2%)，并且所有检出LMoV病毒的卷丹中均能检测到LSV病毒，因此推测正常卷丹在被LSV感染后，被其他病毒(如LMoV)感染的机率会显著增加。在实际生产中，非专业技术人员很难掌握传统剥取0.3～0.5 mm最适茎尖技术。因此，基于应用为主要目的，构建一套操作简便且脱毒效果优良的百合脱毒技术显得非常紧迫。

表7 激素和培养基对不定芽的增殖效果Table 7 Proliferation respone of phytohormone and media to adventitious bud

表8 蔗糖对生根的诱导Table 8 Response of sucrose content to rooting induction

在第一次茎尖脱毒培养中，尽管选择最优消毒方案[1]，但茎尖污染率仍然偏高，平均为 23.33%，推测可能珠芽中含有部分内生真菌。在2次茎尖脱毒培养中，以无菌组培苗为材料，污染率显著降低，平均为10.83%。从脱毒效果来看，1次珠芽茎尖脱毒培养，LSV脱毒率(52%)高于LMoV脱毒率(44%)。而经过2次茎尖脱毒培养后，两者的脱毒效果相当，均高于85%。经过2次茎尖脱毒培养后，脱毒效果均大幅度提升，与郑丽娜等[21]发现单纯通过茎尖培养，2次茎尖培养比1次茎尖培养脱毒效果更好的结论一致。与利用小于0.8 mm的茎尖脱毒相比[14, 22]，本研究利用高低温交叉处理结合2次剥取1 mm左右 (<1.5 mm)茎尖脱毒培养，获得了理想的脱毒效果(脱毒率> 85%)。该方法打破了一般认为茎尖大于1.0 mm达不到脱毒效果的认识，为百合脱毒方法的改进提供了新的思路。经过2次茎尖脱毒处理，虽然耗时长，但剥取茎尖可在肉眼下直接操作，降低设备需求及操作技能，降低污染率；同时选择较大茎尖，明显提高茎尖存活率(未污染的茎尖存活率达90%)。该方法有利于卷丹脱毒苗的工厂化生产，由于试验只针对LSV、LMoV 2种病毒进行测试，其他病毒是否也能达到相同效果有待研究。

卷丹的组培快繁主要以种球鳞片、珠芽鳞片或小鳞茎为材料[1,15,23-24]。本研究尝试以无菌小鳞茎外层鳞片为材料，通过比较不同部位不定芽诱导效果发现：下部鳞片>整瓣鳞片>上部鳞片，其中，下部鳞片不定芽诱导系数可达6.35，与付娜等[25]发现百合单瓣珠芽基部在组培时不定芽诱导数最多的结果一致。本试验发现，上部鳞片诱导产生不定芽主要位于横切伤口处，其余位置并未有不定芽产生，表明影响鳞片诱导的因素除激素配比外，还包含切口位置及大小。下部鳞片诱导出的不定芽除了在切口处，其周边都有不定芽产生。这可能是下部鳞片产生更多不定芽的原因。在以整瓣鳞片为外植体的诱导过程中，不定芽的发生位点也主要位于基部。另外，本研究获得不定芽的增殖随着6-BA质量浓度升高而随之增加，最优增殖培养基为MS+2.5 mg/L 6-BA+ 0.3 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，增殖倍数达 3.39，与周晓波等[15]的研究结果相似，高质量浓度6-BA有利于不定芽发生。在生根培养过程中发现，卷丹在常规继代培养基只要添加一定量的(30～100 g/L)蔗糖便可以生根，但是在50 g/L时生根效果最佳。如果低于30 g/L或者不添加蔗糖，生根率就很低，这与前人的研究有所不同[15,26]，前期结果主要强调NAA和活性炭对百合生根的影响，而本试验首次发现C源对卷丹生根具有重要作用。另外，减少大量元素(如利用1/2MS代替MS培养基)促进根的提前形成。

4 结 论

在重庆南川区引种的湖南卷丹主要感染病毒为百合斑驳病毒(LMoV)和百合无症病毒(LSV)。以卷丹珠芽为材料，通过高温(38 ℃)和低温(4 ℃)的交替处理，结合2次茎尖脱毒培养能有效去除百合LSV和LMoV病毒，脱毒率超过85%以上；剥取的茎尖长度为1.0～1.5 mm，对仪器要求不高、容易操作，且茎尖更容易存活，存活率达90%。进一步利用无毒幼苗的外层鳞片下部进行组培快繁，提高了不定芽诱导系数和增殖系数，最佳芽诱导培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，芽诱导系数为6.35，最佳芽增殖培养基为MS+ 2.5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA + 30 g/L蔗糖，增殖系数为3.39。鳞片在含50 g/L蔗糖的生根培养基中诱导效果最优，生根率为98.72%。本研究获取大量优质脱毒幼苗，方法简便、高效，为重庆地区卷丹产业发展奠定基础。