南疆巴州地区奶牛隐性乳腺炎性金黄色葡萄球菌的MLST分型及其药物敏感性分析

吴自豪 吕俊凡 廖光华 任 强 陈 伟,*

（1塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（2新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中常见造成奶牛养殖业重大经济损失的疾病之一，其可引起奶牛中原料奶的产量、品质下降，同时严重危害奶牛的健康[1-2]。奶牛乳腺炎是我国奶牛发病情况最为频繁的疾病之一，发病率达20%～70%，其中临床型乳房炎的发病率为 9.7%～55.6%，隐性乳腺炎的发病率为61.03%～79.62%[3]。研究表明，奶牛隐性乳腺炎的临床症状与病原菌的生存方式密切相关，其中引起奶牛乳腺炎的一个重要病原菌是金黄色葡萄球菌[4]。金黄色葡萄球菌是一种普遍存在的人畜共患菌[5-6]，可在人和动物间交叉传播，不仅会引起畜禽的疾病，还会对人类健康造成威胁。近年来金黄色葡萄球菌的耐药性呈增高趋势，并且随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureusMRSA）菌株的出现[7]，给金黄色葡萄球菌的防治带来极大困难。因此，了解和掌握金黄色葡萄球菌的药物敏感性，对指导临床用药具有十分重要的意义。

基因分型在确定病原菌、菌株分型和了解菌株间的相关性，探究菌株分型与药物敏感关系等方面具有重要意义。多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）[8]是近年来广泛运用的一种分子分型方法，以7个持家基因（arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi,yqiL）PCR片段序列的多态性分析为基础，比较它们的等位基因谱。MLST建有大型数据库的国际网站，可在线分析菌株的遗传相关性，重复性好[9]。本研究拟对新疆南疆地区奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌进行MLST分子分型和药物敏感性研究，探索MLST分型与耐药性之间的关系，为防治奶牛隐性乳腺炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集与菌株

对来自新疆巴州地区某奶牛场的经兰州隐性乳腺炎检测法（LMT）检测出的8头患有隐性乳腺炎的奶牛，每个乳区使用医用酒精擦拭消毒，弃去前期挤出的乳样后，用无菌试管收集每个乳区的乳样10 mL，共17份乳样，保存于4℃冰盒。金黄色葡萄球菌ATCC25923由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂及仪器

金黄色葡萄球菌的7个持家基因（arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi,yqiL）扩增引物[10]、nuc基因扩增引物[11]（见表 1）、Tris、SDS、EDTA、dNTP、Easy Taq 酶、Easy Taq buffer，均购自上海生工生物工程有限公司；PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪购自Bio-Rad公司；药敏片头孢西丁（CFX）、头孢噻吩（CF）、诺氟沙星（NOR）、庆大霉素（GM）、克林霉素（CM），均购自温州市泰康生物科技有限公司。健康兔血清由塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室提供。

1.1.3 培养基

MSA/MSB培养基用于选择性划线分离培养金黄色葡萄球菌，TSA/TSB培养基用于金黄色葡萄球菌的增殖培养，MHA/MHB培养基用于K-B纸片法药敏试验。

表1 引物名称及序列

1.2 方法

1.2.1 葡萄球菌的分离

吸取50 μL牛乳分别加入5 mL MSB/TSB培养基中，37℃培养24～36 h后，划线接种到MSA培养基上，37℃培养18～24 h。挑取大而圆、边缘整齐、表面光滑、中度隆起的金黄色或乳白色菌落，进行革兰染色、镜检，呈葡萄串状、革兰染色阳性的菌保存于20%甘油管，-80℃贮存。

1.2.2 金黄色葡萄球菌的生化鉴定

1.2.2.1 触酶试验

在一张洁净的载玻片上滴加少量3%H2O2，用接种环挑取少量待检细菌菌落，混匀于3%H2O2中，30 s内观察有无气泡产生。如果产生气泡，则为阳性（+），反之则为阴性（-）[12]。以金黄色葡萄球菌ATCC25923、生理盐水分别做阳性对照和阴性对照。

1.2.2.2 血浆凝固酶试验

洁净的1.5 mL离心管中加入1:10的兔血浆1 mL，然后加入在37℃恒温中培养18～24 h的菌悬液100 μL，将其充分混匀，并置于37℃恒温培养箱中培养，定时观察。如果培养物凝集成胶冻状，则为阳性（+），反之则为阴性（-）[12]。以金黄色葡萄球菌ATCC25923、生理盐水分别做阳性对照和阴性对照。

1.2.2.3 甘露醇发酵试验

取分离株接种于高盐甘露醇琼脂（MSA）培养基上，37℃培养18～24 h后观察。如果菌落周围的MSA由红色变为黄色则表示甘露醇发酵为阳性（+），未发生变化则表示甘露醇发酵为阴性（-）。以金黄色葡萄球菌ATCC25923做阳性对照。

1.2.3 金黄色葡萄球菌的nuc基因扩增鉴定

通过镜检筛选为葡萄球菌的菌株全部进行nuc基因扩增，同时以金黄色葡萄球菌ATCC25923作阳性对照，扩增产物大小在279 bp且为单一明亮条带的菌株确定为金黄色葡萄球菌[11]。

1.2.4 药物敏感性实验

根据生化鉴定和nuc基因扩增结果，采用K-B纸片法对鉴定为金黄色葡萄球菌的菌株进行药物敏感性检测，按美国临床和实验室标准协会指南（CLSI,2017）标准操作。将在MHB中37℃条件下恒温培养6～8 h的细菌混悬液，用MHB稀释至0.5个麦氏标准，然后使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于MHA上，贴药敏片，同时使用标准金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌株。质控菌株抑菌圈直径在质控范围内可对待测菌株进行药物敏感实验结果判定，根据指南判断细菌对5种药物的敏感程度，可分为敏感、中介、耐药，判断标准见表2。

表2 药物敏感性判断标准

1.2.5 多位点序列分子分型（MLST）

通过PCR扩增金黄色葡萄球菌的7个持家基因（arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi,yqiL），扩增引物序列与片段预期大小如表1所示。依据不同菌株持家基因内部位点存在不同程度的突变，将序列在MLST官方网站（https://pubmlst.org/saureus/）进行对比，获得菌株序列型。本实验采用50 μL PCR扩增体系：ddH2O（40.7 μL）、Easy Taq 酶（0.3 μL）、Easy Taq buffer（5 μL）、dNTP（1 μL）、上下游引物各1 μL。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、54℃退火45 s、72℃延伸50 s，30个循环，72℃最后延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定

从17份隐性乳腺炎乳样品中分离出46株呈葡萄串状、革兰染色阳性的菌株，经生化试验及nuc基因扩增鉴定得到金黄色葡萄球菌25株。25株金黄色葡萄球菌生化试验结果统计如表3所示。

表3 25株金黄色葡萄球菌鉴定结果

2.2 药物敏感性检测

对25株金黄色葡萄球菌进行5种抗生素的药物敏感性检测。头孢类抗生素2种：头孢噻吩（CF）、头孢西丁（CFX）；林可酰胺类抗生素1种：克林霉素（CM）；氨基糖苷类抗生素1种：庆大霉素（GM）；喹诺酮类抗菌药1种：诺氟沙星（NOR）。结果表明，25株金黄色葡萄球菌具有不同程度的耐药性，耐药菌株中部分菌株为多重耐药。25株菌株对诺氟沙星和克林霉素的耐药率最高，为36%；其次为庆大霉素，耐药率为28%；对头孢西丁以及头孢噻吩的耐药率均为0%。其中对三种药物（CM、NOR、GM）耐药的菌株有7株（28%），对两种药物（CM、NOR）耐药的菌株有2株（8%）（结果见表4）。

表4 药敏试验结果

2.3 MLST分型

通过MLST分型分析，结果表明25株金黄色葡萄球菌分别属于 7个 STs：ST398（36%）、ST22（20%）、ST5405（16%）、ST5406（16%）、ST5812（4%）、ST5819（4%）、ST5820（4%）；其中ST5812、ST5819、ST5820为本研究中发现的新STs（表5）。

表5 MLST分型结果

表6 MLST分型与5种抗生素耐药性的关系

3 讨论

金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎对奶牛产业造成巨大影响，且奶牛隐性乳腺炎中的金黄色葡萄球菌可作为食源性病原菌威胁人类健康[13]。金黄色葡萄球菌的种内分型较多，尤其是近年来MRSA的不断出现，使临床用药更加困难。因此，探索金黄色葡萄球菌种内分型与药物敏感性的关系，对临床精准用药具有十分重要的意义。本研究采用MLST的分型方法，对来自隐性乳腺炎奶样的25株金黄色葡萄球菌进行分子分型，同时检测对五种抗生素的敏感性。

药敏试验结果表明，本研究中的菌株对头孢类药物敏感，而对林可酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素和喹诺酮类抗菌药均产生了耐药性。本研究所确定的7个序列型中，属于6种ST型（ST22、ST5405、ST5406、ST5812、ST5819和 ST5820）的所有菌株对 5种药物均敏感。而属于ST398型的9株菌株均存在对氨基糖苷类抗生素（庆大霉素，77.78%）、林可酰胺类抗生素（克林霉素，100%）、喹诺酮类抗菌药（诺氟沙星，100%）的多重耐药现象（如表6所示）。表明金黄色葡萄球菌的MLST分型与药物敏感性存在正相关。

本研究从新疆巴州地区隐性乳腺炎奶样分离获得的金黄色葡萄球菌属于7个STs，其中3个为本研究发现的新序列型。本课题组在前期研究中从新疆巴州地区奶样中分离的金黄色葡萄球菌属于18个STs，除了ST398为两项研究共有的序列型外，其余17个序列型均与本研究确定的序列型不同，且也为本课题组发现的新序列型[14]，说明巴州地区乳源金黄色葡萄球菌分子分型具有多样性，值得进一步研究。与来自新疆其他7个地区的12个STs[10]相比，本研究分离的金黄色葡萄球菌MLST分型结果完全不同，没有任何一个相同的序列型。说明地域不同，金黄色葡萄球菌分子分型截然不同。与新疆地区以外的省市相比，有学者从北京市奶源中分离的金黄色葡萄球菌属于5种STs[15]，其中仅ST398为本研究共有的序列型。上述研究结果表明，金黄色葡萄球菌种内分子分型具有复杂的多样性。不同地域的菌株分子分型差异明显，即使是相同地区，也有多种不同的分子分型。而金黄色葡萄球菌不同分子分型与抗菌药物敏感性之间呈现一定的相关性，因此给临床用药带来很大困难[14]。

在金黄色葡萄球菌的MLST分型研究中，ST398型金黄色葡萄球菌在食品卫生和公共卫生安全方面具有重要意义。ST398型金黄色葡萄球菌来源于多种畜禽，且可从国内外多个地区分离获得，是食源性金黄色葡萄球菌污染动物性食品的重要序列型，可引起人类的严重感染[16-20]。具有多重耐药表型的ST398型金黄色葡萄球菌，如ST398型MRSA，可对公共卫生和人类疾病治疗造成威胁[17]。在本研究中，分离获得9株ST398型金黄色葡萄球菌，虽然对甲氧西林敏感，但仍具有多重耐药的表型，具有潜在的公共卫生风险。

本研究在鉴定金黄色葡萄球菌的过程中，分离获得1株不发酵甘露醇的金黄色葡萄球菌。甘露醇发酵试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要生化实验[21]，也是衡量金黄色葡萄球菌致病性的重要依据。金黄色葡萄球菌甘露醇发酵与其生理代谢、毒力产生及致病性有一定的关系[22]，但其机制尚未明确。但近年来，越来越多的研究表明，许多分离自慢性感染或长期感染的金黄色葡萄球菌并不发酵甘露醇，如金黄色葡萄球菌的小菌落变异体（Small Colony Variants,SCVs）[23]。不发酵甘露醇的金黄色葡萄球菌，其致病性往往较低，可能引发长期和慢性感染，给临床用药带来困难。因此，深入研究甘露醇代谢途径，尤其是甘露醇发酵机制，有望为新型抗菌药物研发提供新的思路。