高迁移率族蛋白B1对呼吸机相关性肺炎患者短期内撤机的预测价值

孙雪东 严一核 褚韦韦 张亦婷 刘芳 应利君

呼吸机相关性肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）是ICU机械通气患者最常见的感染性疾病之一。重症患者易发生VAP，多与其基础状态、诊疗操作、药物治疗等有关[1]。临床上，往往在患者发生VAP后，医生根据经验和药敏试验结果给予抗生素治疗，如果早期使用广谱抗生素会增加细菌的耐药性。但是VAP病情进展快、过程复杂，因此亟需寻找一种能有效预测VAP病情的指标，指导尽早撤机拔管，进而改善患者的预后。研究表明，高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）与巨噬细胞的吞噬活性、宿主的免疫反应等密切相关，对肺部感染的诊断与预后评估具有一定的价值[2]；但其对VAP患者能否早期撤机拔管的预测价值尚未明确[3]，故本研究作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年1月至2018年12月在绍兴市人民医院行机械通气且发生VAP的62例患者为研究对象，所有患者在确诊VAP后采集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）进行培养。其中男 34例，女 28例；年龄（62.87±15.34）岁；入组时临床肺部感染评分（clinical pulmonary infection score，CPIS）为（4.06±1.67）分，急性生理和慢性健康评分Ⅱ（APACHE Ⅱ）为（17.55±5.32）分；外科术后36例（包括腹部外科术后19例，骨科术后12例，泌尿系统术后5例），脑血管及神经系统病变20例，心肺复苏后3例，其他3例。VAP临床诊断标准依据2013年中华医学会重症医学分会制定的《VAP预防、诊断和治疗指南》，即有创机械通气48 h以上或撤机、拔管后48 h内胸部X线片可见新发或进展性浸润阴影，且同时满足以下任意2项可考虑诊断为 VAP：（1）体温＞38 ℃或＜36 ℃；（2）外周血WBC＞10×109/L 或＜4×109/L；（3）气管支气管内出现脓性分泌物；同时除外肺水肿、急性呼吸窘迫综合征、肺结核、肺栓塞等疾病，结合微生物学诊断。排除标准：（1）患有肺纤维化、免疫性疾病、肺部肿瘤的患者；（2）长期使用激素者；（3）妊娠妇女；（4）年龄＜18 岁；（5）入 ICU 前已明确存在肺部感染者。本研究经医院伦理委员会审查通过，所有患者签署知情同意书。根据临床上发生VAP的时间分成VAP早发（机械通气≤4 d）组32例和晚发（机械通气＞4 d）组30例。

1.2 方法

1.2.1 收集资料 收集患者临床资料，包括性别、年龄、机械通气时间、ICU住院时间以及确诊VAP当天APACHE Ⅱ、CPIS、氧合指数（PaO2/FiO2）、7 d 机械通气撤机拔管率等。

1.2.2 BALF中细胞因子水平检测 采用ELISA法。参照中华医学会呼吸分会制定2002年制定的《BALF细胞学检测技术规范（草案）》。用双层纱布过滤BALF，去除黏液，将滤液放入50 ml的聚丙烯试管中，1 500 r离心10 min，取上清液置于-20℃冰箱内备用。取BALF上清液，使用ELISA试剂盒（Thermo Scientific公司）检测TNF-α、IL-8、HMGB1等细胞因子水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 肺泡巨噬细胞提取及吞噬活性检测 取BALF离心后沉淀物，用10 ml预冷的Hanks液再行悬浮；然后用10 ml预冷的Hanks液清洗2次。将细胞悬液接种到培养瓶中，在37℃、5%CO2环境下孵育90～120 min。轻轻震荡摇匀，去除介质与非黏附细胞；加入1 ml预热的RPMI 1640培养液，轻轻摇匀，清洗3～4次。用1 ml含有5 mM EDTA的PBS孵育5 min，提取黏附的巨噬细胞，移液，加入1 ml肺泡巨噬细胞培养基冷浸。用0.1%的台盼蓝计数评价细胞活力，要求在95%以上。调整细胞浓度为2×106个/ml，分别置于培养板中及若干个有载薄片的培养皿中。成功分离培养巨噬细胞后进行荧光微球吞噬实验，在上述培养皿中按1∶100比例加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记乳胶微球，置于细胞培养箱中37℃孵育60 min，最后用4℃ PBS清洗未被吞噬的微球。使用表面荧光显微镜计数每个巨噬细胞的FITC标记微球个数，每张标本计数50个细胞。

1.2.3 肺泡巨噬细胞内HMGB1蛋白表达检测 采用Western blot法。取分离培养的肺泡巨噬细胞，调整细胞浓度为5×106个/ml，分别置于培养皿中，在冰上操作（加RIPA液裂解，吹打、震摇、离心），取上清液进行SDSPAGE 电泳，转膜，用一抗 HMGB1（1∶1 000，美国 Santa Cruz公司）、β-actin（1∶2 000，美国 Santa Cruz公司）孵育过夜；最后用二抗孵育2h，ECL试剂显色，利用JYClear ECL型化学发光凝胶成像分析系统进行成像。目标蛋白吸光值与内参的比值，即为目标蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料用表示，两组比较采用两独立样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。绘制ROC曲线，分析相关指标对7 d机械通气撤机拔管的预测效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 VAP早发组与晚发组患者性别、年龄以及确诊VAP当天APACHEⅡ、CPIS、PaO2/FiO2比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；晚发组机械通气时间、ICU住院时间明显短于早发组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.2 两组患者BALF中细胞因子水平比较 早发组确诊 VAP时 BALF中 TNF-α、IL-8、HMGB1水平明显高于晚发组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

2.3 两组患者肺泡巨噬细胞吞噬活性及HMGB1蛋白相对表达量比较 VAP晚发组肺泡巨噬细胞吞噬活性（6.6±2.0）强于早发组（4.8±2.7），巨噬细胞中 HMGB1蛋白相对表达量（1.2±0.6）低于早发组（1.9±0.8），差异均有统计学意义（t=2.82、3.98，均 P＜0.05），见图 1。

2.4 BALF中HMGB1水平、肺泡巨噬细胞吞噬活性及HMGB1蛋白相对表达量对7 d机械通气撤机拔管的预测效能 62例患者7 d机械通气撤机拔管44例，占71.0%。BALF中HMGB1水平预测7 d机械通气撤机拔管的 AUC 为 0.75（95%CI：0.65～0.79），截断值为 50.0 μg/L，灵敏度为0.78，特异度为0.70；肺泡巨噬细胞吞噬活性预测7 d机械通气撤机拔管的AUC为0.79（95%CI：0.68～0.90），截断值为 6.5，灵敏度为 0.73，特异度为 0.70；巨噬细胞HMGB1蛋白相对表达量预测7 d机械通气撤机拔管的 AUC 为 0.73（95%CI：0.61～0.86），截断值为1.4，灵敏度为 0.72，特异度为 0.73，见图2。

3 讨论

人工气道解决了患者急性呼吸衰竭的问题，但是会破坏呼吸系统的防御机制。由于危重症患者基础疾病严重、全身免疫功能低下，VAP然是机械通气患者最常见的感染性疾病之一。有文献报道重症患者VAP发病率高达6%～52%，病死率为14%～50%[3]。因此，亟需寻找一种预测患者VAP病情的指标，指导早期撤机拔管，进而改善患者预后[4-5]。目前已有文献报道多种临床指标可能有助于VAP预后的判断，但是存在一些问题，如APATCH Ⅱ、CPIS等在VAP发生早期的特异度或灵敏度不高，降钙素原、CRP等受全身因素的干扰[6-7]。近年来研究表明，HMGB1可能参与了脓毒症的全部病理过程，与巨噬细胞的吞噬活性、宿主的免疫反应密切相关，对肺部的感染诊断和预后评估或许有很大价值[8-9]。

HMGB1是一种高度保守的核蛋白，广泛分布在哺乳动物的细胞内，一旦分泌到细胞外即可诱导炎症反应[10]。研究表明，减少HMGB1从巨噬细胞内向细胞外释放，可以减少组织的炎症反应[11]。有动物实验证明，急性肺损伤促使大鼠肺泡巨噬细胞HMGB1高表达并向外周组织释放，予以干预后可以明显抑制肺组织HMGB1的表达，并激活细胞凋亡通路，对肺组织有一定的保护作用[12]。本研究结果显示，VAP确诊当天两组患者APATCHⅡ、CPIS、PaO2/FiO2差异无统计学意义，但机械通气时间、ICU住院时间差异有统计学意义。进一步检测发现，VAP早发组 BALF中 TNF-α、IL-8、HMGB1水平以及肺泡巨噬细胞HMGB1蛋白相对表达量高于VAP晚发组，巨噬细胞吞噬活性低于VAP晚发组。但是这些指标不能反映组内患者的预后情况，而笔者更关注VAP发生后患者7 d内撤机拔管率，因为呼吸机使用超过1周会增加二次感染发生率，甚至需要采取气管切开等措施[13]。本研究结果发现，BALF中HMGB1水平、肺泡巨噬细胞HMGB1蛋白相对表达量、巨噬细胞吞噬活性对患者7 d撤机拔管均有较高的预测效能。

表1 两组患者临床资料比较

表2 两组患者BALF中细胞因子水平比较

图1 两组患者肺泡巨噬细胞吞噬活性及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）蛋白相对表达量比较[a：两组肺泡巨噬细胞HMGB1蛋白表达的电泳图及相对表达量比较；b：两组患者肺泡巨噬细胞荧光微球吞噬实验结果及吞噬活性比较；与VAP早发组比较，*P＜0.05]

图2 支气管肺泡灌洗液（BALF）中高迁移率族蛋白B1（HMGB1）水平、肺泡巨噬细胞吞噬活性及HMGB1蛋白相对表达量预测7d机械通气撤机拔管的ROC曲线

综上所述，HMGB1和肺泡巨噬细胞吞噬活性可作为预测VAP患者短期内撤机的可靠指标，有助于指导VAP的治疗；但对HMGB1的干预是否能进一步改善VAP患者的预后，有待进一步研究证实。