基于聚类分析中国林蛙皮不同时期多不饱和脂肪酸含量变化规律

汪卓明 孙敬蒙 张小雯 宁劲涛 辛 宇 高文义*

(1.长春中医药大学药学院，长春，130117；2.吉林大学白求恩第一医院药学部，长春，130021)

中国林蛙(Ranachensinensis)是我国传统的名贵动物药，我国著名的集食药用于一身的经济蛙种[1-2]。被大家所熟知的林蛙油是雌性林蛙输卵管的干制品，又称蛤蟆油、雪蛤油，号称“绿色软黄金”，具有补肾益精、养阴润肺、滋补强壮等功能[3]，主要用于身体虚弱、病后失调、精神不足和痨嗽咳血等症。然而，中国林蛙加工生产成林蛙油后，大量的林蛙皮肤被丢弃，造成生物资源的极度浪费。林蛙皮中含有多种有益的活性成分及营养物质[4-5]，例如蛋白质、多糖、生物活性肽以及透明质酸等[6]。除此之外，林蛙皮肤中富含多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，其能通过减少血小板的黏附作用从而降低血栓形成的概率，通过调节肠道菌群来促进脂质代谢，且具有降低血脂、增强脑活力、预防高血压、改善免疫机制缺乏和抗癌等作用[7]。

PUFA是构成生物体内脂肪的一种脂肪酸，也是人体不可缺少的脂肪酸。根据双键的位置及功能可将PUFA分为ω-6系列和ω-3系列。亚油酸和花生四烯酸(arachidonic acid，AA)属ω-6系列，亚麻酸、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)属ω-3系列[8]。各系列PUFA在机体的保护和调节方面都起着重要作用，例如：调节血脂、清理血栓及调节免疫等。另外，DHA是视网膜的重要组成部分，约占视网膜的40%—50%。补充足够的DHA对活化衰落的视网膜细胞很有帮助。同时，DHA是大脑细胞形成发育及运动不可缺少的物质基础，人有记忆力和思维功能都有赖于DHA的维持和提高[9]。AA作为大脑发育的重要物质，对DHA和EPA的合成起着重要作用，且AA能快速地与磷脂结合，使脂肪酸更有效地被机体利用。EPA和DHA还可通过抑制炎症和氧化应激反应的方式改变血管内皮功能，降低全身血管阻力，进而降低高血压。因此，林蛙皮不仅具有美容养颜和延缓衰老的功效，还可以快速缓解疲劳以及提高人体免疫力，拥有巨大的研究意义和开发前景。

中国林蛙在东北地区主要分布于两大山区，即长白山区域和小兴安岭山区，其中长白山区域是主分布区。不仅与地理条件有重要的关系，一年四季各月份的温度及气候等条件也与中国林蛙的生长发育有着密切关系[10]。为此，本实验采用气相色谱法测定靖宇县林蛙产地同年9个不同生长期中国林蛙皮肤中PUFA含量，分析不同时期林蛙皮中PUFA含量变化规律，为改善林蛙养殖条件和确定林蛙皮品质最佳期提供有力的依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 7890B型气相色谱仪(安捷伦公司)；XW-80A型漩涡混合仪(海门市其林贝雨仪器制造有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(河南省予华仪器有限公司)；KXJ-ZZB型离心机(上海安亭科学仪器厂)；IKAT10型匀浆机(北京东方大林科技有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发仪(海门市其林贝雨仪器制造有限公司)；JA5103N型电子天平(上海民侨精细科学仪器有限公司)。

1.2 试剂

37种脂肪酸甲酯混标(XA23076)、十七烷酸内标(批号1002403079)、正己烷(批号WXBC0860V)均由SIGMA公司提供；甲醇(批号20180521)、三氯甲烷(批号20180620)、盐酸(批号20160718)、无水硫酸钠(批号20170301)均由北京化工厂提供；焦性没食子酸(批号20170317)、石油醚(批号20171210)均由天津天泰精细化学品有限公司提供；0.9%生理盐水(批号S17081614-1)由吉林康乃尔药业有限公司提供。

1.3 中国林蛙组织(皮肤)取样

本实验所用中国林蛙均来自于吉林省靖宇县优良林蛙产地，根据中国林蛙生长发育规律，于2018-01-08、2018-03-08、2018-03-19、2018-04-09、2018-04-26、2018-09-05、2018-09-21、2018-10-18和2018-11-27分别去靖宇县当地采集不同发育时期自然条件下的新鲜活体中国林蛙。用毁髓法处死后，立即解剖得到不同时期林蛙皮样品，于-20 ℃冰箱中保存备用。

2 方法与结果

2.1 气相色谱条件

色谱柱：SPTM-2560型色谱柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)。

气体及流量：载气(N2，纯度99.999%)流速0.507 72 mL/min，尾吹流速30.0 mL/min，氢气流速40 mL/min，空气流速400 mL/min。

进样方式：分流进样，进样量1 μL。

温度及程序升温：开始温度100 ℃保持5 min，以4 ℃/min速率升温至240 ℃，保持30 min。

2.2 系统适用性

在“2.1”项气相色谱条件下，可以较好地分离37种脂肪酸甲酯混标和供试品溶液，且内标出峰时间为42.778 min，阴性无干扰，系统适应性良好。结果见表1、图1、图2、图3和图4。

图4 阴性对照色谱图Fig.4 Negative control chromatogram

图3 对照品色谱图Fig.3 Chromatogram of the reference

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of the test sample

图1 37种脂肪酸甲酯混标色谱图Fig.1 37 fatty acid methyl esters mixed standard chromatogram

表1 37种脂肪酸甲酯混标出峰时间Tab.1 37 fatty acid methyl esters mixed peak time

2.3 溶液的配制2.3.1 内标物溶液

精密称取十七烷酸5 mg，置于5 mL量瓶中，加正己烷定容至刻度，充分摇匀，即得。

2.3.2 对照品溶液

精密量取100 μL 37种脂肪酸混合标准品(Supelco 37 Component FAME Mix)置1 mL量瓶中，用正己烷定容至刻度，即得对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液

称取约1 g中国林蛙皮肤，加入焦酚(也称焦性没食子酸)，置于干燥的离心管中，加入NaCl溶液2.5 mL，十七烷酸内标，匀浆，加甲醇，匀浆，加氯仿，匀浆，离心5 min，吸取下层，剩余上层中加氯仿、生理盐水，使用涡旋混合仪涡旋，离心，吸取下层。剩余上层继续加氯仿、生理盐水，涡旋，吸取下层，将3次取的下层溶液合并，置旋转蒸发仪氮气吹干。加入盐酸-甲醇，密封条件下，100 ℃加热30 min，取出放置至室温，加入去离子水、石油醚，涡旋，离心，将上层溶液取出，下层加入石油醚，涡旋，离心，再取出上层，下层溶液加入石油醚，涡旋，离心，取出上层，将所取上层溶液合并，加入去离子水，充分振荡，离心，将下层吸出并弃去，向上层中加入去离子水，充分振荡，离心，将下层吸出并弃去，加入去离子水等量，充分振荡3 min，离心5 min，反复操作，将上层溶液洗至pH 5.0—6.0，上层溶液中加入无水硫酸钠，静置。将液体倒出，置旋转蒸发仪氮气吹干，用正己烷充分溶解并定容置1 mL，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取十七烷酸甲脂对照品溶液(1 mg/mL)0.06 mL、0.09 mL、0.12 mL、0.18 mL、0.24 mL，分别置于1 mL容量瓶中，加正己烷定容至刻度，摇匀，配成不同浓度的十七烷酸甲脂对照品溶液。依次注入气相色谱仪测定，记录峰面积，以对照品色谱峰面积(y)为纵坐标，对照品浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程。结果见表2、图5。

表2 标准曲线的测定结果Tab.2 Standard curve measurement results

图5 内标线性关系曲线Fig.5 Internal standard linear relationship curve

以十七烷酸甲酯浓度(x)为横坐标，色谱峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为y=2 034.7x+11.146，相关系数R2=0.999 3，表明十七烷酸甲酯对照品的线性关系良好。

2.5 重复性

结果表明，PUFA供试品溶液的RSD为2.26%—3.36%，表明测定方法重现性良好。

2.6 稳定性

结果表明，供试品溶液在24 h内测定结果的RSD为1.73%—2.88%，表明供试品的稳定性良好，即24 h内测定结果稳定可靠。

2.7 样品含量测定

于吉林省靖宇县2018年1月、3月、4月、9月、10月及11月取蛙，每个月份按“2.3.3”项下方法平行制备6份独立供试品溶液，再按“2.1”气相色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中各PUFA含量，结果见表5、表6。

表3 重复性试验结果Tab.3 Repeatability test results

表4 稳定性试验结果Tab.4 Stability test results

表5 2018年不同时期中国林蛙皮肤PUFA含量测定结果Tab.5 Results of PUFA content in skin of Rana chensinensis in different periods of 2018 /(mg/100 g)

续表5

表6 不同时期中国林蛙皮中PUFA平均含量Tab.6 Average PUFA content of Rana chensinensis skin in different periods

由图7、图8可知，林蛙皮中EPA、DHA含量变化趋势较为相似，1—4月含量逐渐降低，4—9月含量开始回升，9—11月又开始降低。由图6可知，林蛙皮中AA由1—9月逐渐升高，9—11月降低，9月含量达到最高值。由图9可知全年中国林蛙皮中DHA含量最高，EPA含量次之，AA含量最低。

图6 不同时期中国林蛙皮肤中AA含量变化趋势Fig.6 Trends of AA content in skin of Rana chensinensis in different periods

图7 不同时期中国林蛙皮肤中EPA含量变化趋势Fig.7 Trends of EPA content in skin of Rana chensinensis in different periods

图8 不同时期中国林蛙皮肤中DHA含量变化趋势Fig.8 Trends of DHA content in skin of Rana chensinensis in different periods

图9 不同时期中国林蛙皮肤中AA、EPA和DHA含量变化Fig.9 Cylindrical charts of AA，EPA and DHA contents in skin of Rana chensinensis in different periods

2.8 聚类分析

根据表6用SPSS软件对不同时期林蛙皮肤中PUFA含量进行聚类分析，采用离差平方和法，以欧氏距离为区间进行聚类，将时期2018-01-08、2018-03-08、2018-03-19、2018-04-09、2018-04-26、2018-09-05、2018-09-21、2018-10-18、2018-11-27分别编号为数字1、2、3、4、5、6、7、8、9，结果见图10。

图10 聚类分析Fig.10 Cluster analysis tree

不同时期林蛙皮中重要PUFA平均含量变化见图9，由图9、图10可知，9个时期林蛙皮样品可聚为4大类：时期2018-09-21聚为一类，记为第一类，此类林蛙皮样品中3种重要PUFA含量均明显高于总体平均值；时期2018-09-05聚为一类，记为第二类，此类林蛙皮样品中AA、EPA含量均高于总体平均值，DHA含量均略低于总体平均值；时期2018-01-08、2018-04-26聚为一类，记为第三类，此类林蛙皮样品中3种重要PUFA含量与总体平均值相比有高有低；时期2018-03-08、2018-03-19、2018-04-09、2018-10-18、2018-11-27聚为一类，记为第四类，此类林蛙皮样品中3种重要PUFA含量均低于总体平均值。综上可知，不同时期中国林蛙皮中PUFA含量存在差异，其中时期2018-09-21和2018-09-05中国林蛙皮中PUFA含量较高。

3 小结与讨论

中国林蛙生长过程按时间划分全年可分为7个阶段：第一阶段为深居冬眠期，时间为12至次年2月；第二阶段为出蛰前期，时间为2—3月；第三阶段为出蛰期成蛙产卵期，时间为3—5月；第四阶段为上岸后捕食生长期，时间为5—9月；第五阶段为入蛰前期，时间为9—10月；第六阶段为入蛰期，时间为10—11月；第七阶段为散居冬眠期，时间为11—12月。本实验通过对吉林省靖宇县全年不同时期中国林蛙皮肤中PUFA进行含量测定并聚类分析发现各时期PUFA含量高低顺序为第一类时期含量>第二类时期含量>第三类时期含量>第四类时期含量，即中国林蛙在其深居冬眠期和上岸后捕食生长期时皮肤中重要PUFA含量较高。AA、EPA和DHA等重要PUFA在促进机体代谢、增加供氧量及增强免疫力等方面都有重要作用。由此可知中国林蛙在冬眠期和捕食期这两个急需抗寒和供能的重要时期中都需要大量的PUFA供应。