一株亚洲象金黄色葡萄球菌的分离鉴定

吴 胜 项 勋 阮 谦 高 辉 俞伟辉 段 纲 常 华*

(1.云南农业大学动物医学院，昆明，650201；2.岳阳职业技术学院，岳阳，414000)

葡萄球菌属(Staphylococcus)在自然界广泛存在，并且对生存条件无特殊要求，很难清除。共有28个种，部分种可以引起人和动物的感染，是导致食源性疾病病原之一的人畜共患疾病[1-2]。葡萄球菌的分型有生物学分型和表型标记分型[3]。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的主要致病因子为凝固酶，是葡萄球菌中的主要病原菌[4]。

葡萄球菌的病例逐年升高，其中金黄色葡萄球菌发病率升高极其明显[5]。感染严重甚至会造成败血症毒血症。金黄色葡萄球菌易造成坏死性肺炎、血管内感染、心内膜感染等[6]。家禽在被金黄色葡萄球菌污染的环境中易感，表现为败血型葡萄球菌病[7]。金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要致病菌[8]，小鼠在感染后会出现精神不振，皮肤出现了斑点。金黄色葡萄球菌还会引起人和鼠的腹膜炎、坏死性筋膜炎等[9]。这些有致病能力的金葡球菌会分泌外毒素和破坏细胞质膜的多肽，其中溶血素和双组分杀白细胞素等多种多肽也是由金黄色葡萄球菌分泌的[10]。

目前在畜禽细菌感染的治疗中，广谱抗生素的广泛使用，造成细菌耐药性的产生，给疾病的防治带来困扰。对于野生动物的饲养及疾病的监控防治方面也存在较大差异，抗生素的广泛使用，也是细菌耐药性产生的主要原因。本研究对由送检的西双版纳病死大象进行细菌分离鉴定，检测发现一株耐药金黄色葡萄球菌，为此对其进行动物回归试验，再次分析该菌对其脏器的损害，同时通过药敏试验的分析，为后续防治该疾病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样本来源

西双版纳亚洲象(Elephasmaximus)死后经剖解将心、肝、脾、肺、肾、肠送检，经云南农业大学动物医学院兽医公共卫生重点实验室进行检测分析。

1.2 试剂

试验所需试剂耗材如表1。

表1 试剂Tab.1 The reagent

1.3 试验方法1.3.1 细菌分离纯化及镜检

在超净台中，用无菌的剪刀和镊子，将脏器病变区剪为绿豆大小，放入1.5 mL的离心管中，向离心管中加入1 mL的已高压PBS，将组织剪碎，取菌液加入TSB培养基，置于37 ℃水浴摇床过夜培养。将此菌液接种于TSA平板上培养，挑取TSA平板单菌落转接于TSB中过夜培养。取该菌液涂片、干燥、固定后进行革兰氏染色镜检。

1.3.2 生化鉴定

将筛选纯化的菌液分别接种于生化鉴定管进行检测。分别包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、半乳糖、山梨醇、卫茅醇、鼠李糖、肌醇、绵子糖、蛋白胨水、葡糖糖磷酸盐胨水、葡萄糖胺、氰化钾生长试验管等加入之后放于37 ℃培养箱中培养大约在24—72 h进行观察记录结果。

1.3.3 16S rDNA 基因序列扩增

计算时不考虑结构自重产生的影响，荷载效应全部来自于体外预应力钢束。将预应力荷载等效为沿箱梁纵桥向作用的均布力作用于锚垫板上，所施加的荷载参数如表 1所示。

对细菌的DNA进行粗提，在超净台中，取已纯化的菌液10 μL，加90 μL的双蒸水，放在沸水中煮沸10 min，得到细菌的DNA[11]。以此细菌DNA为模板，用16S rDNA引物27F：5′-3′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：5′-3′GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增基因片段长度约为1 500 bp。反应条件及反应体系如表2、表3，PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳验证。将有目的条带的样品PCR体系扩大为100 μL，按照试剂盒方法进行胶回收目的条带。取5 μL胶回收产物，用1%琼脂糖凝胶电泳验证胶回收后置于-20 ℃保存。

表2 PCR的反应体系Tab.2 The PCR condition

表3 PCR的反应条件Tab.3 The reaction condition of PCR

1.3.4 16S rDNA的TA克隆及验证

连接载体选用 pMD18-T(TaKaRa)，连接体系为4 μL细菌16S rDNA胶回收产物，1 μL pMD 18-T VECTOR，5 μL SOLUTION I，混匀并于16 ℃连接30 min，取连接产物转化进DH5α感受态细胞后涂布筛选白色单菌落，转接液体培养基培养后提取重组质粒，以重组质粒1 μL为模板，引物及PCR反应条件与上一步相同。取各编号PCR产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳初步筛选验证，将验证克隆成功的质粒进行测序。

1.3.5 药敏试验

选择的药敏片为青霉素、新生霉素、新霉素、环丙沙星、呋喃唑酮、头孢氨苄、阿莫西林、恩诺沙星、利福平、大观霉素、复方新诺明、 麦迪霉素、万古霉素等，18 h后观察药敏结果，判定标准按照美国的临床实验室标准化委员会(NCLLS，2009)实行。

1.3.6 致病性研究

通过半数致死量试验得出该分离株的LD50为1.26×107cfu/mL，以108cfu/mL的菌悬液注射试验组小白鼠5只，每只腹腔注射0.5 mL菌悬液；对照组每只腹腔注射0.5 mL灭菌生理盐水，正常饲喂并观察记录发病及死亡情况。采集死亡小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠等组织置于4%多聚甲醛固定，病理组织经包埋后制作切片[12]，切片经伊红染色后置于显微镜观察。

2 结果与分析

经分离筛选菌落后，对纯化菌株进行革兰氏染色。8号菌株在显微镜下呈紫色、球形，为革兰氏阳性菌，结果见图1。8号菌株在TSA平板上为黄色，表面光滑的圆形凸起菌落，生长情况如图2所示。

图1 8号菌革兰氏染色 1 000×Fig.1 No.8 bacterial strain of Gram stain

图2 8号菌在TSA生长Fig.2 No.8 strains grow in TSA

2.2 细菌的16S rDNA基因测序结果

通过对纯化后的细菌提取DNA并进行TA克隆，抽提重组质粒后进行PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳验证条带显示片段大小为1 500 bp左右，与目的片段大小相符，结果如图3所示。

图3 克隆后PCR扩增结果Fig.3 The results of PCR amplification after cloning

将测序结果碱基序列于NCBI中进行Blast比较，在GenBank上该序列与Staphylococcussp.16S rDNA序列同源性最高达到100%，与Staphylococcussp.ORG01 16S rRNA序列同源性最高达到99%，与Staphylococcussp.SW38 16S rDNA序列同源性高达到99%。

2.3 生化鉴定结果

利用新型微生物微量生化鉴定试剂对8号菌株进行鉴定，该分离株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、山梨醇、水杨素、七叶苷、β-半乳糖苷(ONPG)、葡萄糖磷酸盐胨水、葡萄糖铵、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、硝酸盐、氰化钾反应呈阳性，对木糖、卫矛醇、鼠李糖、肌醇、尿素、丙二酸盐、西蒙氏枸橼酸盐、葡萄糖酸盐、苯丙氨酸、绵子糖、硫化氢、明胶反应呈阴性。鉴定结果见表4，图4。

表4 生化鉴定结果Tab.4 Biochemical identification results

2.4 药敏试验结果

将分离纯化后的金黄色葡萄球菌涂布在TSA平板上，在平板上进行药敏试验，试验结果表明：该株金黄色葡萄球菌对环丙沙星、麦迪霉素、利福平、万古霉素高度敏感；大观霉素、新霉素中度敏感；对阿莫西林、头孢氨苄、 林可霉素、青霉素G、新生霉素、呋喃唑酮、恩诺沙星、头孢他啶、卡那霉素、四环素、复方新诺明耐药，药敏结果如表5，判定标准如表6。

表5 葡萄球菌对不同药物敏感性实验结果Tab.5 Staphylococcus on different drug sensitivity test results /mm

表6 判定标准Tab.6 Drug sensitivity test criteria

2.5 致病性研究结果

实验组小鼠在接种金黄色葡萄球菌初期表现为精神状态差，少饮少食，被毛凌乱，随后小鼠肛门粘着粪便，随着病情加重小鼠出现死亡。将死亡小鼠解剖观察发现肺脏淤血，肠道出血水肿及其严重，肾脏也出现水肿。病理切片显示，实验组小白鼠的肠绒毛脱落，基本无正常形态，黏膜固有层充血出血，肠内容物混有红细胞，如图5A；有的肺泡壁破裂而与相邻肺泡沟通形成大空泡，肺泡腔充满浆液，毛细血管充满红细胞，如图5B；肝细胞肿胀，广泛性变性，肝窦变窄，肝细胞核碎裂、溶解，淋巴细胞浸润，如图5C；肾脏间质充满红细胞，肾小球缩小，肾小管上皮细胞破碎填充管腔，如图5D；部分心肌纤维萎缩、断裂，心肌纤维变性均质，心肌纤维间隙有红细胞，毛细血管有红细胞充盈，如图5E；对照组小鼠肠，肺，肝，肾，心的切片分别如图5a，b，c，d，e。

图5 小鼠攻毒分离菌株后病理组织观察Fig.5 Pathological observation of mice after challenged bacteria

3 讨论

本研究通过对西双版纳大象的脏器进行分离培养、纯化、菌体形态学鉴定及PCR鉴定，从脏器中分离到金黄色葡萄球菌。将该株金葡球菌进行动物回归试验发现本分离株可造成小鼠脏器及肠道出血水肿，致病性较强，且症状与袁晨[13]的动物回归试验一致。

临床治疗时抗生素的大量使用，致使金黄色葡萄球菌产生广泛的耐药性[14]，所以对分离菌株进行药敏试验是必要的。本试验所分离菌株对阿莫西林、头孢氨苄、林可霉素、青霉素G、新生霉素、呋喃唑酮、恩诺沙星、头孢他啶、卡那霉素、四环素、复方新诺明耐药，与刘颖等[15]从水产品中分离金黄色葡萄球菌耐青霉素、四环素、复方新诺明的结果大致相同。本株金黄色葡萄球菌耐药性严重且存在多重耐药现象，该结果与Shahbazian等[16]，Syed等[17]的分离株一致。分离株对大观霉素、新霉素中度敏感。由于该株对β-内酰胺类及头孢类普遍产生耐药，对氨基糖苷类药物中度敏感部分耐药，因此在临床治疗时尽量避免使用这几类药物。本试验中环丙沙星、麦迪霉素、利福平、万古霉素都有良好的抗菌作用，建议用此种方法对西双版纳地区的大象进行防治。

由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒频繁发生，抗生素在养殖业的大量滥用，导致越来越多的食品中发现耐药性金黄色葡萄球菌[18]，极易造成食物中毒，在兽医公共卫生学中引发关注。中国2003—2007年食物中毒的病例中有94起是由金黄色葡萄球菌引起的，感染人数达到了2 000多人[19]。该菌株不仅感染人，在海龟(Chelonia)、蝙蝠(Vespertilio)、海豹(Phoca)、绵羊(Ovisaries)、兔(Lepus)、啮齿动物(Rodentia)、猫(Felis)、狗(Canis)、猪(Suidae)、鸟(Aves)、马(Equus)和牛(Bos)[20]中均可发生感染，大象[21]也易感染。最为可怕的是，自从耐万古霉素金黄色葡萄球菌首次在美国病人中分离，越来越多的VRSA菌株被发现，再加上“超级细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的发现及其导致严重的危害，引起了专家及社会大众的关注[22-23]。这不仅增加了该病的治疗难度，也对公共卫生安全造成极大的隐患，因此，应该谨慎使用抗生素，在进行金黄色葡萄球菌病的治疗给药前先做药敏试验筛选药物，避免耐药性的蔓延及转移。同时，应实时监测多重耐药菌株，避免产生VRSA及MRSA菌株，减少其对公共卫生安全的危害。

4 结论

本研究对西双版纳送检的病死大象进行细菌生化鉴定、分离鉴定，检测发现一株金黄色葡萄球菌，药敏试验检测其为多重耐药菌株，动物回归试验分析该菌对其脏器的损害，结果显示该分离株菌对小鼠有很强的致病性。