蔡氏疣螈在中国的分布及补遗

李慧明 杨璧泽 池辉云 赖任燕 刘昌传徐湛荣 朱秀芳 龚世平 陈金平*

(1.广东省科学院，广东省生物资源应用研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州，510260；2.广东省云开山国家级自然保护区，信宜，525300)

1871年，Anderson将在云南龙川县采集到的红瘰疣螈(Tylototritonverrucosus)作为模式种建立了疣螈属(Tylototriton)[1]。Dubois和Raffa⊇lli[2]基于形态特征将疣螈属划分为2个亚属：瑶螈亚属(subgenusYaotriton)和疣螈亚属(subgenusTylototriton)。疣螈属现存24个种。由于属内种类形态特征相似，地理分布区域重叠，一些物种的有效性一直存在许多争议[1，3-5]。随着分子生物学方法的发展与应用，一些隐藏的生物多样性被逐渐揭示出，一些新种被发现，一些被重新划分或命名，也有同物异名被合并[6-7]。Wang等[6]在研究疣螈属种类多样性及其系统发生关系时，将这一进化支系中的24个种类均列入疣螈属进行讨论，基于2个线粒体基因(16S和ND2基因)和2个核基因(NCX1和BDNF基因)重建的串联基因树中将现存种类划分为5个分支，并认为第4分支中细痣疣螈(Tylototritonasperrimus)种组存在隐种。

蔡氏疣螈首次被发现于越南北部的高平省的河江地区，曾被定种为Tylototritonasperrimus，Tylototritonvietnamensis和Tylototritoncf.vietnamensis[1，4，8-9]。后在中国云南麻栗坡县被发现，但仅有线粒体基因组数据被报道，并没有形态学描述[5]。从系统发生关系来看，蔡氏疣螈与分布在热带亚热带地区的海南疣螈(Tylototritonhainanensis)、老挝疣螈(Tylototritonnotialis)、细痣疣螈聚为一支[4]，属于细痣疣螈种组。蔡氏疣螈目前主要分布于与越南北部河江和高平省，分布区域紧邻越南与中国广西边界。

中国地理范围跨度大，生境多样性丰富，具有维持两栖类种类多样性的生态条件。广东云开山国家级自然保护区地处广东省西南部(111°08′19″—111°23′48″E，22°13′58″—22°21′24″N)属亚热带湿润季风气候，为森林生态系统类型的自然保护区，具有较大面积完整的次生南亚热带常绿阔叶林和沟谷雨林，蕴藏着丰富的野生动物资源。疣螈多栖息于海拔650—2 500 m山区溪流或水塘边，喜植被繁茂环境，云开山保护区为疣螈提供了良好的生存环境。目前，疣螈种类广泛分布于中国中部和南部地区(广东、广西、四川、云南、贵州和甘肃省)。对疣螈的研究将使我们能从新的角度上认识分布区域的地理变迁和物种多样性分化，对保护这一珍贵物种的遗传多样性提供重要的基础数据。本研究对广东省信宜云开山国家级自然保护区采到的疣螈标本进行形态学和分子生物学综合分析，讨论了蔡氏疣螈的分类地位。

1 材料和方法

1.1 标本的采集

2018年4月，在广东省信宜云开山国家级自然保护区内一临时性水坑(111°11′38″E，22°16′23″N)采集到6只疣螈标本(5只已死亡，1只活体)。将采集的标本带回实验室进行体长测量、形态特征鉴定及分子标记实验。研究完成后将死亡个体存放于广东省生物资源应用研究所标本馆(编号：GIABR-A-U-2018-001，GIABR-A-U-2018-002，GIABR-A-U-2018-003，GIABR-A-U-2018-004，GIABR-A-U-2018-005)，1只活体带回保护区进行放生。

1.2 ML系统发育树重建

取6只疣螈尾尖少许肌肉作为DNA提取模板，以扩增获得线粒体COI、Cytb、ND1和ND2基因序列，研究中所需的引物序列参考Zhang 等[10]。DNA提取方法按照美基生物(Magen)组织DNA小量提取试剂盒(Hipure Tissue DNA Mini Kit)流程操作。总反应体系为30 μL，反应条件：96 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，此过程进行35个循环；72 ℃延伸10 min。反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测，用SYBR染色，并于凝胶成像系统紫外光下观察电泳结果。序列的纯化和测定工作由天一辉远生物公司完成。所得ABI源文件用DNAstar 6.0双向拼接而成，使用MAFFT v 6.81b[11]、Mesquite(Maddison，2009)[12]和Finch TV 1.5.0对序列进行编辑、排序、手工修改显见的错误。获得的片段在NCBI数据库中搜索序列同源性。

利用RAXML v.8.1.24软件[13]，以镇海棘螈(Echinotritonchinhaiensis)为外类群，将ND1、ND2、Cytb和COI基因序列进行串联分析，使用最大似然法(ML)重建12种疣螈的系统发生树。选择执行快速支持度分析并以搜索的GTRGAMMA为最佳模型，自举检验1 000次。本研究中从NCBI数据库中下载的12个疣螈种类的序列见表1。Figtree软件查看树图。

表1 研究中从NCBI下载获得的疣螈种类的序列号Tab.1 The downloaded sequences and numbers of Tylototriton species from NCBI database

2 结果

2.1 外部形态特征

2018年4月，于广东省云开山自然保护区采集疣螈6只，5雌1雄。雄性个体全长为14.1 cm；雌性个体全长为11.8—12.5 cm，平均体长为(12.2±0.31)cm(n=5)。根据调查发现此种疣螈多分布在保护区海拔500 m以上树林繁茂及布有水坑溪流区域，繁殖季节集中在水体中完成交配繁殖。

主要的形态特征(图1)：身体周身黑色，躯干圆柱形略扁；头部扁平，头宽略大于或等于头长；头侧脊棱明显并向内弯曲；吻端平，鼻孔近吻端；无唇褶；脊椎突出，分节，肋骨结节突出；皮肤粗糙，身体两侧脊棱显著突起且各具一排球形疣粒(14—16粒)，彼此分界明显且排成纵行，仅唇部、指趾末端和尾腹缘光滑；颈褶清晰；尾腹鳍褶延伸至泄殖孔后缘，尾末端钝尖；四肢纤细，后肢略长于前肢，5趾4指，没有蹼，趾长顺序为3>4>2>5>1；雄性泄殖孔竖长状，内壁有小乳突，雌性泄殖孔略短隆起，无乳突；指、趾末端、泄殖孔周缘和尾下缘为橘红色。

图1 Tylototriton ziegleri外部形态特征Fig.2 The female morphology characteristics of Tylototriton ziegleri

2.2 联合基因系统树重建

基于ND1、ND2、Cytb和COI串联基因序列重建了12种疣螈的系统发育ML树(图2)。ML系统发育树主要分为两支，其中本次采集发现的疣螈(SP1—6)与蔡氏疣螈聚在一支，这与传统形态分类结果一致。因此，根据多重线粒体基因序列分析及外部形态特征鉴定，认为此次在云开山保护区发现的疣螈应为蔡氏疣螈，为中国广东省新纪录种。NCBI上传序列号为MH664279-MH664302。

图2 基于ND 1、ND 2、Cyt b和COI基因串联序列重建12种疣螈的ML系统发生树Fig.3 Maximum likelihood tree(ML tree)based on the ND 1，ND 2，Cyt b and COI gene for Tylototriton and related species

3 讨论

疣螈是中国重要的有尾两栖类动物，随着生境的丧失和破碎化其遗传多样性和种类多样性明显降低，种群数量急剧减少，目前部分疣螈种类(细痣疣螈、镇海棘螈、贵州疣螈Tylototritonkweichowensis等)为我国Ⅱ级保护动物。根据本次研究的形态学特征与多重线粒体基因序列比对鉴定此次于广东省云开山国家级自然保护区内发现的疣螈应为蔡氏疣螈，是分布于中国疣螈属中的第5个种，为细痣疣螈种组中的一种。目前蔡氏疣螈仅分布在越南北部河江省、中国云南省麻栗坡县和广东省云开山保护区。

细痣疣螈种组依托秦巴山系、大娄山系、大别山系、南岭、粤桂山系及环北部湾山系分布[7]，其间仍有部分的盲点有待调查。曾有报道在云开山发现细痣疣螈的踪迹，但此次调查并未采集到样本，从分布特征来看，细痣疣螈与蔡氏疣螈可能出现同域分布，疣螈种类在此区域尚可存在更多的物种多样性。根据疣螈属种类系统发生关系，细痣疣螈、海南疣螈、老挝疣螈与蔡氏疣螈的亲缘关系很近，且该分支处于系统树基部，是较原始的一支[6，9，14]。说明疣螈在中国与周边东南亚国家应存在显著基因交流和迁移扩散，周边国家的物种可显著影响中国疣螈种类多样性；另一方面目前蔡氏疣螈独立的分布于与越南北部与中国云南东部、广东西南部，三者间空白的分布区域(比如广西、海南等地)也可能有此种的分布，仅是尚未被发现，待日后工作进一步调查。

近年来，随着疣螈属中新种和隐种的不断发现，对错误种类鉴定同时进行反复的修订，这说明疣螈种类外部形态特征相似，地理分布区域重叠对准确的种类鉴定带来了巨大的困难[3，7]。目前，在《中国两栖动物及其分布彩色图鉴》一书[15]和Wang等[6]发表的文章中均已将瑶螈亚属和疣螈亚属并为疣螈属进行讨论，但尚有多数文献中仍使用亚属或种组来描述疣螈属的划分已不妥当。

因此在以后的工作中以重要外部形态特征为主，补充解剖学特征以及结合分子标记技术辅助鉴定手段是十分必要的。但是在使用不同的分子标记对基因序列进行比对及重建系统树时，可能会出现不同或多个鉴定结果。在本研究中，当进行ND2基因序列比对时，搜索结果中则出现原序列与细痣疣螈和蔡氏疣螈均具有相同的相似度和覆盖率。因此在选用分子生物技术手段辅助种类鉴定时，应选取较多分子标记进行补充，单独的分子标记鉴定结果可能出现偏差。

致谢：感谢此次参与野外调查的所有专家、学者以及广东省云开山自然保护区的工作人员，特别感谢广东省生物资源应用研究所张亮、何向阳和李林妙博士对本研究中样品采集、分子实验及种类鉴定方面提供的帮助。