20株中国医学细菌保藏管理中心标准肺炎克雷伯菌分子生物学特征分析*

刘茹凤，石继春，王春娥，李康，李江姣，徐潇，徐颖华，辛晓芳，叶强(中国食品药品检定研究院细菌多糖和结合疫苗室(医学细菌保藏研究中心)，卫生部生物技术产业鉴定方法及其标准化重点实验室，北京 102629)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KP)可引起败血症、肺炎、泌尿系统感染、手术部位感染和导管相关性感染等院内感染[1-2]，也可造成化脓性肝脓肿等社区获得性感染[3]。荚膜是KP主要的毒力因子之一，目前鉴定有80多个荚膜血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54、K57型与人类各种侵袭性感染密切相关，称为高毒力荚膜血清型KP[4-5]。中国医学细菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections，CMCC)收集保藏的KP主要用作生物安全评估的参考菌种和KP国家参考品的制备，参考品用于KP相关诊断试剂的质量控制，因此参考品菌株及候选菌株的质量控制尤为重要。本研究对CMCC收集保藏的KP进行了鉴定验证和分子生物学的初步分析。

1 材料和方法

1.1菌株来源 20株KP均由CMCC提供，菌株编号分别为CMCC(B)46102、46103、46104、46105、46107、46108、46109、46110、46111、46113、46114、46115、46116、46117、46118、46120、46121、46122、46123和46124。

1.2主要仪器与试剂 Vitek 2 Compact 全自动微生物分析系统(法国生物梅里埃公司)，飞行质谱仪microTyper MS及配套试剂甲酸、乙腈、基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)(江苏天瑞公司)，培养箱(上海印溪公司)，T100基因扩增仪、水平电泳仪、凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)，高速冷冻离心机(Eppendorf公司)；普通琼脂培养基和普通营养肉汤(美国BD公司)，DNeasy Blood & Tissue Kit(德国QIAGEN公司)，Premix Taq试剂、DNA marker DL2000、DL1000(大连宝生物公司)，琼脂糖(美国Promega公司)，引物由上海英潍捷基公司合成。

1.3拉丝试验 用接种环挑起琼脂平板上过夜培养新鲜菌落，重复2次，若2次均有黏液丝形成并且长度大于5 mm，则判为拉丝试验阳性，即该菌株为高黏液(hypermucoviscosity，HMV)表型KP[6]。

1.4DNA提取 将KP接种至普通琼脂培养基上，37 ℃培养18 h，收集菌体，参照DNeasy Blood & Tissue Kit说明书提取基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.516S rRNA基因分析 以提取基因组DNA为模板，应用通用引物[7](引物序列见表1)进行扩增。PCR反应体系为50 μL，包括Premix Taq 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板5 μL，ddH2O 18 μL。PCR 反应条件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后观察结果并拍照。将阳性扩增产物(约为1 400 bp)送上海生工生物公司进行纯化和Sanger法测序，用ABI 3730XL测序仪及配套试剂进行(测序前电泳质控，根据图谱条带质量安排测序)。测序结果序列在NCBI中比对，并应用MegAlign软件将测序结果与已发表的相同种属的模式菌株进行同源性及进化树分析。

表1 本文所用引物序列

1.6荚膜血清型基因检测 采用PCR方法检测KP荚膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54 和K57)[8-9]，引物序列见表1。PCR反应体系为50 μL，包括Premix Taq 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 18 μL。荚膜血清型基因PCR反应条件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳观察并拍照、测序及分析同1.5部分。

1.7多位点序列分型(MLST) 参照Institute Pasteur(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)及相关文献[10]合成引物，以提取的基因组总DNA为模板，对KPgapA、infB、rpoB、phoE、mdh、pgi、tonB7个管家基因进行扩增。PCR反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。选取目的条带切胶回收后进行测序，将测序结果进行拼接，然后在Institute Pasteur数据库中进行比对，获得各管家基因位点的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，判断其序列型(sequence type,ST)。

1.8质谱鉴定 菌种复苏并接种普通琼脂培养基，37 ℃过夜进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析：取少量菌涂满对应靶孔，每株菌2孔，自然干燥后加入1 μL甲酸：乙腈(体积比1∶1)裂解液，自然干燥后，加1 μL HCCA，干燥后进行检测。然后根据分析的主要因素信噪比(signal/noise，S/N)；筛选特异质量峰，方法：S/N≤1.7，鉴定不合格，仪器显示红色；1.7

2 结果

2.1高黏液表型检测及血清荚膜分型分布 20株CMCC保存KP检出黏液丝试验阳性6株，分别为CMCC 46108、46109、46115、46116、46118和46124。检出K2型3株(CMCC 46108、46109、46117)、K5型4株(CMCC 46110、46111、46115、46121)、K54型1株(CMCC 46111)、K57型4株(CMCC 46108、46109、46117、46124)，未检出K1型和K20。在黏液丝阳性菌株中，高毒力荚膜血清型KP检出率为100%；在黏液丝阴性菌株中，高毒力荚膜血清型KP检出率为24.6%(4/14)。

2.216S rRNA 基因分析 20株菌株均扩增出约1 400 bp大小16S rRNA片段，将拼接序列在https://www.ezbiocloud.net中进行比对，与KP模式菌株(DSM 30104)的相似性均>99%，进化树见图1。

2.3质谱鉴定 20株菌株均为KP，且得分均大于2。其中有4株鉴定到亚种，包括肺炎亚种3株(CMCC 46114、46116、46120)和鼻硬结亚种1株(CMCC 46111)。

2.4MLST分型 20株KP分为ST3型4株(CMCC 46105、46113、46114、46120)、ST91型3株(CMCC 46107、46110、46115)、ST86型3株(CMCC 46108、46109、46117)、ST2791型2株(CMCC 46103和46104)、ST67型2株(CMCC 46111、46116)、ST11型2株(CMCC 46118、46122)、ST478型1株(CMCC 46102)、ST15型1株(CMCC 46123)、ST660型1株(CMCC 46124)、ST4073型1株(CMCC 46121)。

3 讨论

CMCC收集保藏的菌种是曾经的流行菌株和模式菌株，本文用PCR方法实现保藏KP菌株荚膜血清分型[11]，用MLST分型获得菌株流行特征[10]，并用质谱技术确定菌种，以评价国家标准菌株质量，并增补之前表型质量指标。20株典藏KP中检出常见的强毒性荚膜型K2、K5、K54和K57型共有12株，包括K2型3株，K5型4株，K54型1株和K57型4株。MLST分型技术将20株菌种分为10个不同ST型，显示KP菌株多样性丰富。质谱技术将其中4株KP鉴定到亚种。

本研究本着对保藏的KP菌株质量控制为出发点，为以后纳入新菌株提供质控指标。从荚膜分型来看，中心收藏的菌株比较全面，可以为研究机构等单位提供高质量、系统、全面的参考菌株。CMCC收藏全球各地菌株，大部分为具有代表性流行株，可为KP研究的进一步发展提供对照。

在KP研究迅速发展的情形下，多角度多方位进行菌种分析鉴定很有必要。本研究在菌种验证方面，补充了菌株的黏液表型、16S rRNA基因、质谱鉴定、MLST分型信息和6种常见高毒力荚膜血清型的鉴定，为KP参考候选菌株的选择提供参考，有利于更好地对相关诊断试剂产品进行质量控制。