多发性骨髓瘤患者ABO血型鉴定异常的原因分析及处理方法

成婧，蒋敏，林春艳，孙灵迪，张靖南，王雪明(苏州大学附属第一医院输血科，江苏苏州215000)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者多伴有贫血，需输血治疗，但是患者外周血成分变化常常会引起ABO血型鉴定困难[1]。本研究对我院近3年177例MM患者中81例血型鉴定异常的原因进行分析并进行相应的处理，保证血型鉴定的准确性，从而保障临床安全用血。

1 对象与方法

1.1研究对象 2016年5月至2019年6月在苏州大学附属第一医院就诊的177例MM患者，均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2015年修订)》中MM的诊断标准,其中男109人，女68人；年龄34～88岁，中位年龄为60.0岁。

1.2标本采集与处理 所有研究对象均抽取EDTA-K2抗凝血2 mL，3 000 r/min(离心半径20 cm)离心5 min。

1.3仪器与试剂 Immucor Galileo NEO全自动血型仪(美国IMMUCOR公司)，恒温水浴箱(苏州铂西瓦公司)，台式离心机(北京白洋公司)，血型血清学离心机(瑞士DiaMed GmbH公司)，PCR仪(德国Eppendorf公司)；抗A、抗B、抗AB与抗H试剂(上海生物医药试剂公司)， ABO标准试剂红细胞(美国IMMUCOR公司)，ABO血型鉴定卡(长春博迅公司)，血液基因组DNA提取试剂盒(CAT：DP318-02，北京天根公司)，Prime STAR Max DNA Polymerase (CAT：R045，日本TaKaRa公司)。

1.4方法

1.4.1ABO及Rh血型鉴定 采用Immucor Galileo NEO全自动血型分析仪进行ABO及Rh血型检测，对血型正反定型不符的标本再采用传统的试管法复检。

1.4.2吸收放散试验 对全自动血型分析仪和传统试管法检测后仍然无法确定血型的标本，采用吸收放散试验。在1 mL压积红细胞中加入等体积相应的标准抗A/抗B单克隆抗体试剂，置4 ℃冰箱吸收2 h后用冰生理盐水洗涤6遍(检测最后1次洗涤的上清液，确保洗涤干净，无加入抗体残留)，再加入等体积生理盐水，置56 ℃水浴箱内不停振摇10 min，立即3 000 r/min离心，吸取上清液100 μL，加入50 μL相应的试剂红细胞离心后观察结果。

1.4.3唾液血型物质测定 辅助鉴定ABO血型，将唾液煮沸10 min，试管中分别加入已标化的抗A、抗B、抗H试剂(以出现3+凝集的最高稀释度作为最适稀释度)，再加入等体积唾液(对照管用生理盐水代替唾液)室温中和5 min后，再分别加入对应的试剂红细胞，混匀，1 000 r/min离心观察结果，具体操作详见《全国临床检验操作规程》(第3版)。

1.4.4生理盐水重悬 对于2例白球比倒置引起的反定型均凝集的标本，离心去除上清液后加入100 μL生理盐水重悬后离心，观察结果。

1.4.5分子生物学基因分型 对3例需要通过分子生物学进一步确定ABO血型的标本，用血液DNA提取试剂盒抽提患者外周血DNA，对其第6和第7外显子进行PCR扩增。参考文献[2]设计引物序列：Exon6-F：5′-TGGAAGGGTGGTCAGAGG-3′，Exon6-R：5′-CTGGAGAAGGAGCTGGGTT-3′，Exon7-F：5′-TGGGAAGAGGATGAAGTGAAT-3′，Exon7-R；5′-CAACAGGACGGACAAAGGA-3′ ，引物由苏州虹讯生物科技公司合成。PCR体系共20 μL，包含基因组DNA模板2 μL(DNA浓度60～140 ng/μL)，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，Primier STAR Max 10 μL，灭菌蒸馏水6 μL。反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共33个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物取5 μL用于15 g/L琼脂糖凝胶电泳，确认有条带后取10 μL PCR扩增产物(未纯化)送苏州虹讯生物科技公司进行Sanger测序，测序仪为ABI 3730系列高通量基因分析仪，用DNAssist 2.2软件将测序结果与GenBank中A101标准序列(NG-006669)进行比对分析。

2 结果

2.1血型鉴定结果 177例MM患者中，有81名血型鉴定异常。经过各种对应的方法处理后，确保血型鉴定无误。原因分析、处理方法具体见表1。

表1 81例血型鉴定异常MM患者的原因分析及处理方法

2.281例MM患者血型鉴定异常的具体血型血清学结果 见表2。

表2 81例MM患者的血型血清学结果

2.3测序结果 对2例抗A、抗B抗体均缺失和1例A抗原减弱患者ABO基因第6、7外显子进行PCR扩增及测序，用DNAssist 2.2软件将测序结果与A101标准序列进行比对，结果显示2例抗A、抗B抗体均缺失的患者ABO基因第6外显子均存在261delG(图1)，基因型为O01/O01；1例A抗原减弱的患者ABO基因第7外显子存在467C>T(图2)，基因型为A102/A102。

3 讨论

MM是恶性浆细胞病中多发的一种类型，特征是正常的浆细胞转变为恶性骨髓瘤细胞，并产生大量异常的免疫球蛋白，称为M蛋白或者副蛋白[3]。

MM患者M蛋白的大量分泌影响了正常免疫球蛋白和特异性抗体的分泌，导致ABO血型反定型抗A、抗B抗体(主要是IgM类抗体)减弱甚至缺失[4]。本研究中81例ABO血型鉴定异常中有72例抗体减弱，6例抗体缺失。处理方法：在反定型试管中血浆加量至2～3倍，室温静置10 min让抗原抗体充分反应后再多次离心观察结果。这种方法增加了抗原抗体反应的凝集强度，提高了ABO血型鉴定的正反定型符合率，另外抗体丢失案例再配合吸收放散试验和唾液试验来确证血型。遇到2例抗A、抗B均缺失的患者采用分子生物学方法鉴定血型，结果显示血型皆为O01/O01。

此外，M蛋白的大量分泌可导致患者血浆中球蛋白含量增高，白球比倒置，球蛋白异常增多并包裹红细胞，使红细胞表面的负电荷减少，红细胞之间的排斥力减弱从而引起异常的缗钱状凝集[5]。本次实验中81例ABO血型鉴定异常者中有2例为蛋白质凝集干扰。处理方法：试管法离心后，反定型管弃去上清液，加入100 μL生理盐水重悬后再次离心观察，缗钱状凝集即可消散，而抗原抗体的真凝集则不会消散[6]。

MM患者引起ABO血型抗原减弱的机制尚不明确，可能与以下因素存在一定的相关性：血浆中异常M蛋白的大量增多使合成A、B抗原的糖基转移酶缺乏或受到抑制，导致H抗原转变为A或B抗原被阻断[7]；MM患者的骨髓造血功能异常，分泌大量浆细胞，使红细胞系统受到抑制，成熟红细胞减少或形态发生改变，可能导致红细胞表面血型抗原减弱[8]；ABO基因和癌基因c-abl都位于第9号染色体上q34位点，有可能癌基因干扰了ABO基因，从而引起ABO抗原减弱[9]。本次实验中81例ABO血型鉴定异常者中有1例抗原减弱。处理方法：在排除ABO亚型的前提下，增加了吸收放散试验、唾液试验和基因检测，分子生物学检测后结果显示患者ABO血型基因型为基因型为A102/A102，证实为抗原减弱。

综上所述，MM患者由于抗体减弱或缺失、抗原减弱、白球比倒置等因素可引起ABO血型鉴定异常，日常工作中需要结合病史，综合生化结果、临床用药情况等各方面原因，正确选择试管法、吸收放散试验、唾液血型物质检测等血清学方法，必要时采用分子生物学基因分型以确保血型鉴定的正确性，从而保障临床安全用血[10]。