三结构域蛋白14在结直肠癌组织中的表达及临床意义

丁 燕， 夏雨佳， 胡 明

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院肿瘤科，武汉 430014

最新流行病学数据显示，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在我国恶性肿瘤的发病率和死亡率均高居第5位，严重威胁国民的生命健康[1]。近年来，随着结肠镜的普及和包括手术、放化疗及分子靶向治疗等在内的多种治疗手段的不断进步，一定程度改善了CRC患者的临床预后，但其总体生存率仍不尽如人意[2]。CRC的发生进展是一个多因素参与的复杂多步骤过程，其潜在分子机制仍不清楚[3]。因此，探究CRC恶性进展机制，寻找新的治疗靶点及预后指标，对于改善CRC的预后具有重要意义。三结构域蛋白14(tripartite motif 14，TRIM14)作为三结构域蛋白家族的一员，表达于多种细胞，广泛参与调节机体的多种生物学过程[4]。最近的研究表明，TRIM14在肝细胞癌[5]、骨肉瘤[6]、口腔鳞状细胞癌[7]、乳腺癌[8]、胶质瘤[9]及胃癌[10]等多种恶性肿瘤中异常表达，与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移及药物耐受等密切相关。然而，TRIM14在CRC中的表达及其与患者临床病理学特征及远期预后的关系，尚未见报道。鉴于此，本研究通过免疫组化方法检测了TRIM14在129例CRC组织中的表达水平，并进一步分析其与患者临床病理学特征的关系，探究TRIM14表达在CRC远期预后中的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择于2014年1月～2015年12月在武汉市中心医院接受手术治疗的CRC患者为研究对象。纳入标准：经病理学明确诊断为CRC；术前未进行任何抗肿瘤治疗；接受规范性的根治手术治疗；患者临床资料和随访资料完整。排除标准：术前已转移、接受姑息性切除的患者；5年内有其他恶性肿瘤既往史者。按照上述纳入和排除标准，最终共有129例CRC患者纳入本回顾性分析。纳入患者的平均年龄为(63.65±9.01)岁，患者的术后病理分期采用国际抗癌协会(Union for International Cancer Control，UICC)第7版肿瘤分期系统。本研究获得华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院伦理委员会批准。

1.2 免疫组化染色

组织标本采用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、制作成4μm厚组织切片，60 ℃烤片2 h，二甲苯溶液浸泡2×15 min进行脱蜡。依次以不同浓度乙醇(100%、95%、90%、75%、70%)水化各5 min，再采用柠檬酸钠(10 mmol/L，pH 6.0)微波20 min进行抗原修复，置于室温冷却30 min。再用甲醇配制的3%过氧化氢处理20 min以阻断内源性过氧化物酶。5%牛血清蛋白封闭2 h后，孵育兔抗TRIM14一抗(1∶500，美国Abcam公司)，4 ℃过夜，次日滴加标记有HRP的二抗(山羊抗兔二抗，武汉赛维尔生物科技有限公司)，室温孵育30 min，DAB显色，显微镜下控制反应时间。苏木精行细胞核复染，乙醇水化及二甲苯透明，中性树胶封片，在奥林巴斯光学显微镜下进行阅片和结果判定。

1.3 免疫组化结果评分

免疫组化染色结果判定根据每个高倍镜视野中阳性细胞所占比例和染色强度进行评分，具体如下：在200倍视野下随机选取10个不重复的视野，计数200个CRC细胞及正常细胞，分别根据染色强度及阳性细胞百分率进行读片。染色强度：0分(阴性)，1分(弱阳性，淡黄色)，2分(中等强度，黄色)和3分(强阳性，棕黄色或褐色)；阳性细胞百分率：0分(≤5%)，1分(～25%)，2分(～50%)，3分(～75%)，4分(>75%)。以两项评分的乘积为最终的评分，10个视野评分结果取平均值，0分定为阴性(-)，总分≤6分定义为低表达，>6分定义为高表达。

1.4 临床资料收集整理

通过查阅患者病历档案，收集患者临床病理信息，包括性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、淋巴管浸润情况、有无神经侵犯、术前癌胚抗原(CEA)水平及TNM分期等。采用电话随访或门诊复诊的方式，自手术当日起进行随访，截止时间为2019年4月30日。记录患者总生存(overall survival，OS)时间和无复发生存(recurrence-free survival，RFS)时间。OS：确诊之日至患者死亡或最后1次随访日期；RFS：确诊之日至局部复发或远处转移或最后1次随访日期。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 TRIM14在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达水平

免疫组化检测显示：TRIM14蛋白主要定位于细胞质和细胞核，其在CRC组织和癌旁组织中均有表达，在癌组织中的表达强度显著高于癌旁组织，见图1。

图1 免疫组化检测TRIM14在结直肠癌及癌旁组织中的表达Fig.1 Immunohistochemical analysis of the expression of TRIM14 in colorectal cancer and paracancerous tissues

免疫组化染色评分：肿瘤组织及癌旁组织TRIM14评分分别为(9.462±3.735)分和(3.738±1.214)分，肿瘤组织评分显著高于癌旁组织(t=16.554，P<0.01)。

2.2 TRIM14表达与结直肠癌临床病理特征的关系

根据肿瘤组织免疫组化评分判定TRIM14在75例CRC组织中呈高表达(评分>6分)，高表达率为58.14%(75/129)。进一步分析发现，CRC组织中TRIM14高表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、淋巴管浸润、神经侵犯及TNM分期显著相关(均P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度及术前CEA水平无显著相关性(均P>0.05)，见表1。

表1 TRIM14表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系(n=129)Table 1 Relationship between TRIM14 expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer(n=129)

2.3 TRIM14表达与结直肠癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析及Log-rank检验结果显示，高表达TRIM14组CRC患者的无复发生存率显著低于低表达组(P<0.01，图2A)；高表达TRIM14组CRC患者的总生存率亦显著低于低表达组(P<0.01，图2B)。

A：无复发生存；B：总生存图2 结直肠癌组织中TRIM14表达水平与患者预后的关系Fig.2 Relationship between TRIM14 expression level and prognosis of patients with colorectal cancer

2.4 影响结直肠癌患者预后的危险因素分析

单因素分析显示，肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、淋巴管浸润、神经侵犯、TNM分期及TRIM14表达水平是影响CRC患者RFS和OS的危险因素(均P<0.05)，见表2；进一步Cox比例风险模型多因素分析表明，TNM分期及TRIM14表达水平是影响患者RFS和OS的独立危险因素(均P<0.01)，见表3。

表2 影响结直肠癌患者无复发生存期和总生存期相关风险因素的单因素分析Table 2 Univariate analysis of risk factors related to recurrence-free survival and overall survival of colorectal cancer patients

表3 影响结直肠癌患者无复发生存期和总生存期相关风险因素的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of risk factors related to recurrence-free survival and overall survival of colorectal cancer patients

3 讨论

TRIM家族是一类超大基因家族，包括了75个家族成员，越来越多的证据表明，TRIM家族蛋白与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[11]。对于CRC，既往研究已发现TRIM24和TRIM29在CRC组织中显著上调，发挥促癌基因的功能，参与CRC的发生、发展、侵袭和转移[12-13]。在本研究中，我们通过分析了129例CRC组织中TRIM14的表达水平及其与患者临床病理学特征和预后的相关性，证实了TRIM14在CRC组织中表达显著上调，并与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、淋巴管浸润、神经侵犯及TNM分期等多种不良临床病理因素显著相关。进一步的单因素和多因素分析发现，TRIM14高表达是影响患者无复发生存和总生存的独立预后因素。上述研究结果提示，TRIM14在CRC的发生发展中也扮演着促癌基因的角色，癌组织中TRIM14高表达预示着不良预后。

TRIM14作为TRIM家族的重要一员，既往研究报道其主要在机体的先天性免疫调节[14]和免疫抗感染[15]等方面发挥重要功能。最近，其在恶性肿瘤发生发展及预后评估中的价值逐渐被研究者关注[5-10]。Dong等[5]研究发现TRIM14在肝癌组织中的表达显著上调，其高表达与肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯，TNM分期和巴塞罗那肝癌分期密切相关，进一步分析表明TRIM14高表达是影响肝癌患者OS和RFS的独立预后因素；Xu等[6]研究表明TRIM14在人骨肉瘤组织和细胞系中上调，并与骨肉瘤患者较短的无进展生存期和OS相关；Tan等[9]发现TRIM14在胶质瘤标本(包括组织和细胞系)中过表达，并且高水平的TRIM14预示着患者的预后不良；此外，杜天明等[10]分析TRIM14在189例胃癌组织中的表达水平及其临床意义，发现无论是在mRNA还是在蛋白水平，癌组织中的TRIM14表达均明显高于癌旁组织，其表达水平是影响胃癌患者无瘤生存期和OS的独立因素。结合本研究结果，提示TRIM14可促进恶性肿瘤的进展进而影响患者的临床预后，检测其表达水平可作为判断CRC患者预后的重要指标。

关于TRIM14促进CRC进展的潜在分子机制，目前研究仍较少。Jin等[16]通过体外实验表明，TRIM14可通过激活SPHK1/STAT3信号通路促进CRC细胞的迁移和侵袭能力；Shen等[17]通过一系列体外和体内实验发现，TRIM14可通过抑制PTEN的表达促进AKT通路的磷酸化进而增强CRC细胞的增殖能力和抑制其凋亡，介导CRC的发生和发展。在其他类型肿瘤中，Xu等[6]发现TRIM14可通过激活AKT信号通路介导骨肉瘤细胞的上皮间质转化(EMT)过程，从而促进肿瘤细胞的生长，迁移和侵袭；在乳腺癌中，TRIM14可通过抑制SHP-1的表达进而激活p-STAT3通路，从而促进乳腺癌细胞的增殖并抑制其凋亡[8]；此外，TRIM14可通过稳定Dvl2从而激活Wnt/β-catenin通路来促进胶质瘤的化疗耐药[9]。基于上述研究结果，我们推测TRIM14可能通过多种机制或与其他分子相互作用促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭，从而发挥其促癌活性。

综上所述，本研究显示TRIM14在CRC组织中表达显著上调，其高表达与CRC多种不良临床病理特征及患者的不良预后密切相关，可作为评估CRC患者预后的潜在生物标志物。对TRIM14在CRC中的具体作用机制、信号通路及潜在抗肿瘤效应的深层次研究，有望为揭示CRC转移机制和寻找新的治疗靶点提供新思路。