敲减缺氧诱导因子-2α联合索拉非尼对肾癌细胞促凋亡作用的研究*

程 乾，周 婕，柴大飞△，郑骏年△

1.徐州医科大学 肿瘤研究所(徐州 221002)；2.徐州市科技情报研究所(徐州 221000)

肾癌在泌尿系统恶性肿瘤中发生率高居第3位，发病率在恶性肿瘤中占3%～5%[1]，25%～30%患者在就诊时出现转移[2]。由于肾癌对放、化疗不敏感，这使肾癌的临床治疗成为一大难题[3]，因此，需探索新的治疗肾癌方案应用于临床。索拉非尼作为一线治疗和免疫治疗失败病人二线治疗的靶向药，治疗转移性肾癌的多激酶抑制剂，对细胞具有抑制增殖、促进凋亡及对血管具有生成抑制等作用，疾病控制率和无进展生存期较好。但由于反应率低、药物抵抗性的原因，晚期肾癌患者的中位生存期也仅能延长17.8～24.2个月[4-5]，因此针对索拉非尼耐药性产生机制的方案探寻，是提高索拉非尼在中晚期肾癌疗效尤为重要的一环。缺氧是肿瘤细胞对药物治疗产生耐药的重要因素，在此环境下，缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor, HIF-1α)及HIF-2α蛋白表达增加、降解减少和稳定性提高，HIF能够促进细胞增殖与抑制凋亡、促进血管生成、促进细胞转移，对抗肿瘤药物有耐药作用[6-7]。本研究旨在探讨缺氧环境下，HIF-1α与HIF-2α的变化，以及敲减HIF-2α引起索拉非尼协同促进肾癌细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象 人肾癌细胞(OS-RC-2、786-O)购自中科院上海分院细胞库。

1.1.2 主要试剂 改良型RPMI 1640培养基(美国Hyclone公司，批号：NZG1090)；胎牛血清(美国Hyclone公司，批号：RB35932)；噻唑蓝(MTT)(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：MTO792)；BCA试剂盒(中国Solarbio公司，货号：PC0020)；流式凋亡试剂盒(江苏凯基生物公司，批号：20191003)。慢病毒介导的shRNA：Control shRNA、HIF-1α shRNA、HIF-2α shRNA(美国Santa Cruz公司，货号：sc-108080、sc-35561-V、sc-35316-V)；病毒转染优化剂聚凝胺(美国Santa Cruz公司，货号：sc-134220)；HIF-1α、HIF-2α抗体(美国R&D公司，MAB1536、AF2997)；Caspase3抗体、GAPDH抗体(上海碧云天生物技术有限公司，货号：AC030、AF1186)；TUNEL检测试剂盒(美国Promega公司，货号：G3250)；碘化丙啶(美国Sigma公司，货号：P4170-10MG)。

1.1.3 主要仪器 流式细胞仪(美国BD公司，型号：Canto Ⅱ)；三气培养箱(美国Thermo公司，型号：3131)；化学发光仪(上海天能科技有限公司，型号：5200)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 RPMI 1640培养基(10%胎牛血清)，常氧状态下，细胞于培养箱(5% CO2、37 ℃)中培养；缺氧状态下于三气培养箱(1% O2、5% CO2、37 ℃、94% N2)中培养。

1.2.2 细胞感染 分别取如上两种对数生长期肾癌细胞接种于12孔板，10 000 个/孔，待细胞50%融合后改置于三气培养箱中培养。向每孔加入完全培养基(含5 mg/L聚凝胺)，再加入慢病毒(含Control shRNA或HIF-1α shRNA或HIF-2α shRNA)10 MOI，8 h后去上清，加入1 mL完全培养基培养24 h后，收集细胞。

1.2.3 蛋白质印迹技术(Western blot)法测定蛋白水平 用BCA法测定细胞提取的总蛋白浓度，用溴酚蓝缓冲液调齐浓度，煮沸变性，电泳，湿转，封闭，孵一、二抗，洗涤，用辣根过氧化物酶显色，化学发光拍照。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 取对数生长期的两种细胞，调整细胞数为1×104个/孔，接种于含有载玻片的12孔板，待细胞50%融合后，置三气培养箱中培养，分别为：对照组(不加任何药物)、索拉非尼组(索拉非尼5 μmol/L)、索拉非尼+Control shRNA组(索拉非尼5 μmol/L+Control shRNA 10 MOI)、索拉非尼+HIF-2α shRNA组(索拉非尼5 μmol/L+HIF-2α shRNA 10 MOI)，每组3个复孔。24 h后取转染后的上述两种肾癌细胞，胰酶消化，洗涤，离去上清，用0.5 mL Annexin V溶液重悬，调整细胞质量浓度至1×109个/L，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，避光3 min；加入20 mg/L PI染液10 μL，避光10 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡 根据1.2.4分组的细胞，按照TUNEL试剂盒步骤操作，荧光显微镜下观察结果，计算阳性率。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 索拉非尼在缺氧环境下调控肾癌细胞HIF-2α、HIF-1α的表达

OS-RC-2、786-O细胞在常氧环境下，HIF-1α和HIF-2α表达量很低，而在缺氧环境下表达明显上调；在缺氧条件下，HIF-1α shRNA或HIF-2α shRNA均可以分别降低OS-RC-2、786-O细胞中HIF-1α或HIF-2α的表达，与对照组比较，索拉非尼组能够使HIF-1α表达下降，且能够使HIF-2α蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

2.2 HIF-2α调控缺氧环境下索拉非尼促进OS-RC-2、786-O细胞凋亡

缺氧环境下，与对照组比较，索拉非尼可明显增强OS-RC-2细胞的凋亡(23.52±3.26vs5.32±1.23，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA组与索拉非尼+Control shRNA组相比，细胞凋亡增加明显(44.36±2.21vs23.32±3.63，P<0.05)，索拉非尼组与索拉非尼+Control shRNA组相比，差异无统计学意义(23.32±3.63vs23.52±3.26，P>0.05)。与对照组相比，索拉非尼可增强肾癌786-O细胞凋亡(12.36±3.19vs3.21±1.09，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA组与索拉非尼+Control shRNA组相比，细胞凋亡增加明显(33.52±5.23vs12.66±3.69，P<0.05)，索拉非尼组与索拉非尼+Control shRNA组相比，凋亡差异无统计学意义(12.36±3.19vs12.66±3.69，P>0.05)。TUNEL结果如下，与对照组比较，索拉非尼可明显增强OS-RC-2细胞的凋亡(21.26±3.19vs1.91±0.60，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA组与索拉非尼+Control shRNA组相比，细胞凋亡增加明显(49.23±5.11vs19.91±4.19，P<0.05)，索拉非尼组与索拉非尼+Control shRNA组相比，差异无统计学意义(20.96±3.19vs19.91.52±4.19，P>0.05)。与对照组相比，索拉非尼可增强肾癌786-O细胞凋亡(13.51±3.02vs1.01±0.52，P<0.05)，索拉非尼+HIF-2α shRNA组与索拉非尼+Control shRNA组相比，细胞凋亡增加明显(57.13±5.23vs13.60±3.62，P<0.05)，索拉非尼组与索拉非尼+Control shRNA组相比，差异无统计学意义(13.50±3.02vs13.60±3.62，P>0.05)(图2)。

2.3 缺氧环境下HIF-2α对肾癌OS-RC-2、786-O细胞Caspase3蛋白的影响

缺氧环境下，分别将细胞用Western blot法检测Caspase3蛋白表达，在OS-RC-2、786-O细胞中，与对照组比较，索拉非尼以及索拉非尼与HIF-2α shRNA联用可使Pro-Caspase3表达下降、Cleaved Caspase3蛋白表达升高，与索拉非尼+Control shRNA组相比，索拉非尼+HIF-2α shRNA联用组的Pro-Caspase3表达下降，Cleaved Caspase3表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

3 讨论

HIF-1α与HIF-2α蛋白在常氧条件下因泛素化降解而不能稳定存在，在肿瘤组织的缺氧环境下，因HIF-1α与HIF-2α蛋白表达较高，泛素化降解作用较弱，从而使HIF-1α与HIF-2α蛋白能够高表达且稳定性存在[8]，本实验结果印证了这一观点。缺氧时，当HIF-1α的表达低时则会代偿性使HIF-2α表达上调，反之亦然[9]。HIF-1α与HIF-2α是肿瘤细胞在缺氧环境下发生凋亡抵抗的关键蛋白[10]。

索拉非尼治疗晚期肾癌患者的原理是通过抑制Ras/Raf激酶活性、PDGF受体、EGFP受体等途径来抑制新生血管生成及肿瘤细胞增殖[11]。由于有效率过低，因而探寻索拉非尼的耐药机制，是提高索拉非尼在中晚期肾癌疗效的关键所在。本研究发现，索拉非尼能够明显下调肾癌细胞中HIF-1α表达，代偿性升高了影响索拉非尼发挥其药物敏感性的关键蛋白HIF-2α的表达。本研究用shRNA敲减肾癌细胞中HIF-2α表达后，实现对HIF-1α和HIF-2α双重抑制，从而使索拉非尼促肾癌细胞凋亡的活性有了明显提高，表明HIF-2α和索拉非尼联用可以协同促进肾癌细胞凋亡，且这种凋亡途径是通过调控Caspase3蛋白来实现的。

综上所述，本研究发现肾癌细胞缺氧环境下，HIF-2α蛋白是影响索拉非尼药物敏感性的重要角色，而不是HIF-1α。敲减HIF-2α有可能成为提高索拉非尼联合用药治疗中晚期肾癌患者的重要手段。