食管癌及其淋巴结转移癌组织中血清应答因子与α-平滑肌肌动蛋白差异表达的意义

何喜，王志强，林韬

作者单位：唐山市人民医院胸外科，河北 唐山063001

食管鳞癌淋巴结转移是影响食管癌预后的主要因素之一，区域淋巴结转移被认为是食管癌病人术后预后不良的指标之一［1］。课题组前期采用免疫组织化学染色方法，发现血清应答因子（serum response factor，SRF）在食管癌组织中高表达，且与浸润深度和淋巴结转移关系密切，与α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的高表达呈正相关；体外研究也显示基因沉默SRF能够抑制Eca-109细胞的增殖和侵袭［2］。SRF转录因子能够与α-SMA基因启动子结合并促进其转录，被认为是肿瘤细胞上皮-间质转化的一个重要指标之一［3］。因此本研究拟观察SRF在食管癌组织及其淋巴结转移中的差异表达，并观察其与临床病理参数以及α-SMA表达的相关性，为研究食管鳞癌发生淋巴结转移机制提供一定的理论基础和实验依据。

1 资料及方法

1.1一般资料收集2017年1月至2018年12月在唐山市人民医院行食管癌根治性手术的病人样本68例，均伴有淋巴结转移。其中男性46例，女性22例；年龄≥65岁30例，＜65岁38例；肿瘤直径≥3 cm 36例，肿瘤直径＜3 cm 32例。按照食管癌国际TNM分期标准（第8版），鳞癌临床TNM分期I+II期14例，III期54例；浸润深度T1+T2 12例，T3+T4 56例；淋巴结转移N1为10例，N2+N3为58例。所有标本均经苏木素伊红染色后病理证实，临床资料完整。所有病人术前均未行放化疗治疗。病人或近亲属对研究方案签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2方法

1.2.1 HE染色 石蜡切片脱蜡至水，苏木素10 min，盐酸酒精分化数秒，稍洗，伊红1～2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.2 免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡至水，高压修复，3%H2O2去除内源性过氧化物酶，SRF（sc-335，美国santa cruz公司）、α-SMA（ab124964，英国abcam公司）一抗（1：200）4℃过夜，二抗37℃孵育20 min，DAB显色，苏木素轻度复染，中性树胶封固。阳性结果判定标准：SRF主要表达于细胞核，α-SMA表达主要位于细胞质。参照文献方法判定、分析免疫组织化学染色结果［2］，即染色强度评分：0（无表达）、1（弱表达）、2（中等程度表达）、强表达（3）；染色百分比评分：0（＜10%）、1（10-30%）、2（31-70%）、3（＞70%）。以染色强度评分与染色百分比评分乘积作为免疫组织化学染色评判结果，其中≤3分定义为阴性，＞3分定义为阳性。

1.3统计学方法采用SPSS 13.0统计学软件，组间计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SRF、α-SMA在食管癌淋巴结转移癌组织中高表达SRF主要表达于细胞核；α-SMA主要表达于细胞质，其中在平滑肌组织中的阳性表达不定义为阳性结果。在食管鳞癌淋巴结转移癌组织中的SRF、α-SMA阳性表达率分别为73.53%和77.94%，显著高于原位癌组的52.94%和44.12%，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表1。

表1 SRF、α-SMA在食管癌原位癌组织和淋巴结转移癌组织中的差异表达∕例

2.2 SRF、α-SMA在食管鳞癌淋巴结转移癌中的表达与临床病理特征的联系SRF、α-SMA在食管鳞癌淋巴结转移癌标本中的表达与性别、年龄、肿瘤大小无关（P＞0.05），而与浸润深度、淋巴结转移区域和TNM分期关系密切（P＜0.05）。SRF与α-SMA在食管鳞癌淋巴结转移癌中共表达45例，二者具有正相关性（r＝0.485，P＜0.001）。见表2。

3 讨论

SRF作为MADS基因家族的成员之一，可能调控200多个相应的靶基因，在胚胎发育、肌肉、消化系统、神经系统的形成，以及肿瘤的发生、发展中起到了重要的调控作用［4］。在体内外沉默SRF，能够显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，并抑制荷瘤小鼠的生长，与肿瘤的恶性转移关系密切［3］。其他研究也显示，SRF在肝癌组织中高表达，其可结合微小染色体维持蛋白7启动子并促进其转录，抑制SRF能够显著抑制肝肿瘤干细胞的形成和相关基因的表达［5］。基因敲除SRF能够下调早期生长反应1蛋白的表达，从而抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化［6］。在本研究中也发现，SRF在淋巴结转移癌组织中的阳性率显著高于原位癌组织，并与浸润深度、淋巴结转移区域、远处转移和TNM分期关系密切，提示SRF可能是调控食管鳞癌转移的一个重要的转录因子。

表2 SRF、α-SMA在食管鳞癌淋巴结转移癌中的表达与临床病理参数的关系

SRF能够与α-SMA基因启动子结合并促进其转录，多项研究证实SRF通过对E-钙黏蛋白、β-连环蛋白、α-SMA等上皮-间质转化指标的调节，从而促进了肿瘤的发生、发展，或在纤维化进程中起到重要的调控作用［2，7-9］。课题组较早就将α-SMA作为肿瘤细胞上皮间质转化的指标进行研究，在本研究中也发现，α-SMA除可以标记肿瘤相关成纤维细胞［10］以外，在淋巴结转移癌中阳性表达无论是强度还是阳性表达率，显著高于原位癌组织。α-SMA在食管癌淋巴结转移癌中的异常高表达，提示食管癌细胞可能经历上皮间质转化，从而获得了迁移和运动的能力，因而促进了肿瘤细胞的侵袭和转移。然而本研究属于半定量、描述性研究，在后续实验中，将采用免疫印迹和PCR技术定量检测SRF及α-SMA蛋白和基因水平的差异表达，以期可将SRF作为早期预测食管鳞癌淋巴结转移的标记物进行深入研究。

图1 血清应答因子、α-平滑肌肌动蛋白在食管鳞癌原位癌及淋巴结转移癌组织中的阳性表达