四川省攀西地区山羊泰勒虫病血清学检测

郝桂英，袁晓琴，陈永航，莫 全，严光文，李凤琴，杨应东，万 洁，文建国，吉色曲伍

（1.西昌学院动物科学学院，四川西昌 615013；2.攀枝花市农林科学研究院畜牧水产所，四川攀枝花 617061；3.凉山彝族自治州农业农村局，四川西昌 615000）

山羊泰勒虫病（caprine theileriosis）是由顶复门（Apicomplexa）梨形虫纲（Piroplasmea）梨形虫目（Piroplasmida）泰勒科（Theileriidae）泰勒属（Theileria）的原虫寄生于山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的一类由媒介蜱传播的血液原虫病[1]。该病主要发生于热带、亚热带和温带地区，呈地方性流行，以高热、贫血、消瘦、体表淋巴结肿大为主要临床特征，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病羊发育迟缓，产肉量显著下降，给养羊业造成巨大经济损失，严重制约养羊业发展[2]。

我国流行的羊泰勒虫主要是尤氏泰勒虫（T.uilenbergi）、吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）和绵羊泰勒虫（T.ovis）[3]。由于泰勒虫病为蜱传性疾病，因此该病的流行随媒介蜱的分布和活动，呈现出明显的地方性和季节性特征。羊泰勒虫病在新疆、内蒙古、辽宁、吉林、甘肃、青海、宁夏、河北、河南、山西、陕西、山东、湖北、浙江、江苏、广东、贵州、重庆、四川等19 个省市区均有报道。近年来，随着养羊业的迅速发展，我国羊泰勒虫病的发生呈上升趋势。而该病在自然感染病例中常为隐性感染，因而增加了该病的防控难度[4]。

血涂片镜检法常用于泰勒虫病的诊断，然而其灵敏性低，所以检出率也低，易出现漏检和误诊，在检测领域受到一定的限制。随着免疫学和分子生物学技术的发展，越来越多的检测方法被建立并用于泰勒虫病检测，其中酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）具有较好的特异性和灵敏性，操作简便，易于标准化，对试验条件要求不高，更适于基层实验室大量血清样品的检测，因此被广泛用于流行病学调查研究[5-7]。

攀西地区位于四川省西南部，在安宁河、金沙江和雅砻江交汇处，山场广阔，是四川省养羊的传统产区之一，在全省养羊业中具有举足轻重的地位。随着农业产业结构调整，养羊业已成为攀西地区脱贫致富的主要途径。目前，羊散养在攀西地区仍占主导地位，且蜱在该地区分布广泛，因此该地区养羊业受到泰勒虫病的潜在威胁。迄今，仅见郭淑珍等[8]报道，2001—2002 年凉山彝族自治州羊泰勒虫病发病率为70%（35/50），死亡率为40%（20/50）。为了解四川省攀西地区山羊泰勒虫病流行情况，采用双抗原夹心ELISA 方法，对采自凉山州和攀枝花市的640 份山羊血清进行泰勒虫病血清学检测，以期为当地羊泰勒虫病防制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清 2013 年11月—2019 年12月，在四川省凉山州西昌市（427 份）、布拖县（36 份）、会理县（31 份）、会东县（20 份）、美姑县（10 份）、宁南县（20 份）、普格县（36 份）、盐源县（19份），以及攀枝花市米易县（19 份）、盐边县（22 份）等10 个县/市，无菌采集640 份山羊血，其中136份采集自西昌市养羊场，其余样品均采自羊散养户。待血液凝固析出血清后，3 000 r/min 离心10 min，分离血清，编号后于-20 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 羊抗泰勒虫病ELISA 检测试剂盒，购自北京绿源伯德生物科技有限公司，其抗原为吕氏泰勒虫重组表达表面蛋白（rTlSP）。

1.2 方法

1.2.1 双抗原夹心ELISA 法检测 根据羊抗泰勒虫病ELISA 检测试剂盒说明书进行操作。使用前，将试剂盒置于室温平衡20 min 后，取出所需量酶标板条，设空白对照1 孔，阴性及阳性对照各2 孔。在阴、阳性对照孔，分别加入阴、阳性对照各50 µL；在待测样品孔，先加待测血清10 µL，再加样本稀释液40 µL；随后在阴、阳性对照孔和待测样品孔中，每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原100 µL，用封板膜封住反应孔，37 ℃温育1 h。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min。甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5 次。每孔加入底物液A、B 各50 µL，37 ℃避光温育15 min。每孔加入终止液50 µL，用空白孔调零，在450 nm波长处测定各孔吸光值（OD值）。

1.2.2 结果判定 试验有效性：阳性对照孔OD平均值≥1.00，阴性对照孔OD 平均值≤0.15。临界值（cut-off）计算：临界值=阴性对照孔OD 平均值+0.15。结果判定：样品OD 值＞临界值，为血清抗体阳性，反之为阴性。

1.2.3 数据分析 采用SPSS 22.0统计分析软件，对不同地区和季节的检测结果进行卡方检验。P＜0.05 为差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同地区

攀西地区10 个县/市羊泰勒虫血清抗体阳性率介于52.78%～100%，平均阳性率为73.44%（表1），表明该地区羊泰勒虫病流行较严重。经卡方检验，10 个县/市的羊泰勒虫血清抗体阳性率差异显著（χ2=54.392，P＜0.01），表明该地区羊泰勒虫病呈现一定的区域分布特点。

表1 不同县/市羊泰勒虫病血清学检测结果

2.2 不同季节

按不同季节进行分组比较，春季（3月—5月）、夏季（6月—8月）、秋季（9月—11月）、冬季（12月—次年2月）血清抗体阳性率介于65.42%～95.24%，其中春季最高、秋季最低（表2）。经卡方检验，不同季节血清抗体阳性率差异显著（χ2=38.157，P＜0.01），表明该地区羊泰勒虫病呈现较明显的季节性特征。

3 讨论

我国存在的长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）和青海血蜱（H.qinghaiensis）均能传播尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫[9]，小亚璃眼蜱（Hyalomma anatolicum anatolicum）可传播绵羊泰勒虫[10]。我国大部分地区均有不同程度地羊泰勒虫病流行，因此羊放牧时被蜱叮咬而感染的风险较高。攀西地区林草资源丰富，为蜱的滋生提供了有利的环境，因而导致该地区羊泰勒虫病流行率较高。

表2 不同季节羊泰勒虫病血清学检测结果

ELISA 是目前应用最广泛的羊泰勒虫病血清学检测方法。目前已建立了几种基于裂殖子粗抗原和重组抗原的间接ELISA 方法，用于泰勒虫抗体检测。Gao等[5]基于泰勒虫裂殖子粗抗原建立的间接ELISA 方法，可检测尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫，但与羊巴贝斯虫有交叉反应，还存在标准化难、需要感染实验动物以获取制备抗原等缺点。Guo等[11]用裂殖子粗抗原间接ELISA 方法，对甘肃省甘南藏族自治州7 个地区进行泰勒虫病流行情况调查，发现甘南地区泰勒虫平均阳性率为70.1%，不同地区阳性率介于27.8%～83.3%。Niu等[12]用裂殖子粗抗原间接ELISA 方法，对采集自辽宁辽阳、河北兴隆、内蒙古通辽、四川秦岭以及甘肃天祝、甘南等地共1 234 份羊血清进行泰勒虫检测，发现总阳性率为66.78%（824/1 234），各地阳性率介于0～80.9%，其中甘南地区阳性率为71.3%，辽阳、兴隆、通辽的阳性率均为0。

其他检测小反刍动物泰勒虫病的ELISA 方法均是基于重组表达抗原建立的。Miranda等[13]用克隆表达的Theileriasp.（China）热休克蛋白70（TcHSP70）作为抗原建立的间接ELISA方法虽然与环形泰勒虫（T.annulata）无交叉反应，但并没有用田间样品进行验证。Bakheit等[14]用莱氏泰勒虫裂殖子Clone-5 基因的重组表达蛋白作为抗原建立了间接ELISA 方法（Clone-5XP2 ELISA），其敏感性和特异性分别为94.6%和88.0%，与分离自我国的泰勒虫和考德里氏体属（Cowdriaspp.）无交叉反应。Liu等[15]基于尤氏泰勒虫重组免疫蛋白（rTuIP）建立的间接ELISA 方法的特异性和灵敏性分别为98.44%和97.92%，仅与吕氏泰勒虫有交叉反应，与莱氏泰勒虫、巴贝斯虫未定种、羊无形体无交叉反应。后来，Liu等[16]用rTuIP-ELISA 方法，对湖北随州、贵州贵阳以及甘肃天祝和麻当的羊泰勒虫病流行情况进行调查，发现阳性率分别为17.8%、11.6%、97.4%、97.0%，认为rTuIP-ELISA 方法可作为吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫流行病学调查的工具。Abdo等[17]基于尤氏泰勒虫裂殖子cDNA 文库的表面蛋白（Clone-9）建立了间接ELISA（rc9b-ELISA）方法，发现其灵敏性和特异性分别为87.7%和57.1%，与rTuIP-ELISA 的阳性符合率为85%。李有全等[18]以吕氏泰勒虫重组表达表面蛋白（rTlSP）作为抗原建立的间接ELISA 方法与绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、东方泰勒虫（T.orientalis）、中华泰勒虫（T.sinensis）有交叉反应，但与巴贝斯虫无交叉反应。He等[6]报道rTlSP-ELISA 方法的特异性和灵敏性分别为97.9%和97.1%，并用该方法对采集自甘肃省的240 份绵羊血清进行检测，发现阳性率（63.75%）高于血涂片镜检阳性率（46.67%）。Li等[19]用rTlSPELISA 方法，对采集自吉林、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西、安徽、浙江、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆、重庆、四川、西藏、湖南、贵州、云南、广西、广东等21 个省区市的2 351 份羊血清进行检测，发现平均阳性率为41.0%（965/2 351），其中甘肃省阳性率最高，为76.0%，四川省为18.7%，河北省为0。Li等[20]用rTlSP-ELISA 方法，对我国北方牛泰勒虫病成功进行了血清学调查。

尽管已经建立了多种羊泰勒虫病血清学诊断方法，但血清学检测存在不能区分耐过动物，不易区分相近虫种的交叉感染而出现假阳性等缺点，目前还没有一种血清学方法能明确、特异地区分吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫。而与基于DNA 的分子生物学方法相比，ELISA 具有成本更低、更易操作等优点，在大规模流行病学研究中具有很高的适用性。

本次检测用rTlSP 抗原包被的双抗原夹心ELISA，对攀西地区的羊血清进行检测，发现攀西地区山羊泰勒虫血清抗体阳性率为73.44%，高于青海等地的报道。李英等[21]用ELISA 方法，对青海天峻地区绵羊群进行泰勒虫病血清学调查，发现血清抗体阳性率为18.68%（17/91）。尕松代吉[22]用ELISA 方法，对青海玉树州羊群进行泰勒虫病血清学调查，发现血清抗体阳性率为49.74%（382/768）。本次检测发现，攀西地区10 个县/市的羊泰勒虫血清抗体阳性率介于52.78%～100%，地区差异显著。这些地区差异可能与不同地区蜱的分布以及蜱的泰勒虫携带率不同有关。

本次检测结果与秦思源等[23]对甘肃省玛曲不同季节牦牛双芽巴贝斯虫感染结果基本一致，但与Guo等[11]报道的甘肃省甘南藏族自治州羊泰勒虫抗体检测结果稍有差异。甘肃甘南藏族自治州羊泰勒虫抗体的血清阳性率从3月份开始上升，到5月份达到最高（68.2%），10月份开始下降，到次年1月份降至最低（36.4%）。这是因为不同地区蜱的活动时间并不一致。攀西地区春季和夏季阳性率高于秋季和冬季，可能与春季和夏季的气候条件更适合蜱的生存与繁殖有关。

本次检测发现，攀西地区羊泰勒虫血清抗体阳性率较高（73.44%）。这提示有关部门应加强监测并采取灭蜱等措施，以控制该病的流行与传播。本检测初步了解了羊泰勒虫病在攀西地区的分布及流行状况，但由于采样时间和采样数量的局限，检测结果并不能全面真实反映该病的流行与分布情况，但可以为该病的防制提供一定的参考。

4 结论

检测表明，攀西地区羊泰勒虫病流行较为严重，且呈现明显的地区和季节性暴发特点，因此在高发地区和高发季节，应采取监测和灭蜱等措施来控制该病流行。