核转位在肿瘤发生发展中的研究进展

周 杰，黄英辉

(陆军军医大学 1.西南医院 肿瘤科； 2.预防医学院 复合伤研究所， 重庆 400038)

肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病[1]。中国肿瘤病死率自2006年以来有所降低，但是仍然是中国居民重要的死亡原因，也是最主要的公共健康问题，全球肿瘤发病率和病死率也依然在快速增长[1]。因此，对于肿瘤的发生发展，依然是值得广大研究者不断去深入探索的一个主题。

肿瘤发生发展是一个多因素参与的过程，这个过程中包括了抑癌基因的失活、癌基因的异常激活、蛋白表达的空间时间发生紊乱等，而胞核-胞质(nuclear-cytoplasmic translocation，简称“核转位”)转位则在上述过程中扮演了重要的角色，最终导致肿瘤恶性程度高、治疗效果差。因此，核转位近年来也愈发受到广大研究者的关注，如：对核转位进行调控可治疗难治性肺癌；代谢调节酶PFKFB3的核转位异常可促进糖酵解[2]等。因此，本文对核转位通路的基本结构、生物学功能及其调控机制进行综述，旨在

探索通过调控功能蛋白的核转位而抑制肿瘤，将从一个新的角度探究肿瘤发生发展的分子机制及其干预措施。

1 核转位通路的基本结构

真核细胞的细胞质、细胞核被细胞核膜分隔开。细胞核内的功能蛋白在胞质中合成，经过唯一的通道——核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)进入胞核，在细胞增殖、分化、凋亡和基因表达调控等过程中发挥了重要作用[3]。小分子物质可通过主动扩散在胞核胞质之间移位，而大分子蛋白、复合物等则需要借助于核转位受体介导的主动运输。

1.1 核孔复合体

NPC又称为核孔蛋白，为具有“分子筛”功能的孔状结构，镶嵌于核膜，故命名为“核孔”。 NPC形状类似于篮球网状结构，内外各有8个球状颗粒，核孔中央有一个中心颗粒，中心颗粒的细丝与16个球状颗粒相互连接。NPC分子质量为125 ku，由30余种高度保守的蛋白构成，它能提供靶蛋白与核转位受体的结合位点，使其通过NPC入核[4]。

1.2 核转位信号

核转位信号主要包括入核信号(nuclear localization signal，NLS)和出核信号(nuclear export signal，NES)。二者均为富含碱性氨基酸的肽段，一般不超过8～10个氨基酸。NLS通常分为两类：4～7个氨基酸构成的短基本序列，以及由两个延伸的基本氨基酸序列组成的较长的二部分序列，该序列由5～20个保守性较低的氨基酸隔开[5]。NES则大致符合以下序列Φ-X2-3-Φ-X2-3-Φ-X-Φ(Φ=L,I,V,F,M; X为任意氨基酸)[6]。靶蛋白需要具备核转位信号才能被核转运受体识别，而携带核转位信号并非一定就会发生核转位。核转运信号被覆盖或者被修饰均会导致核转位失败[2,7]。

1.3 核转运受体

核转运受体Karyopherin是一种受体蛋白，与选择性转运密切相关。Karyopherin家族包括Karyopherin α和Karyopherin β[8]。Karyopherin β(Kapβ，importin/exportin)亚家族包含超过20个成员，发挥入核或出核转运的功能。Karyopherin β1(Kpnβ1)，又叫Importinβ，是主要的入核转运受体。而Karyopherin β亚家族中：CAS、染色质区域维持因子1(chromosomal region maintenance 1，CRM1)、exportin-t、MSN5是目前已证明的参与出核的4种转运蛋白。Karyopherin α(Kpn α)，又叫Importin α，是NLS的受体蛋白，其C端为NLS结合域，N端为Karyopherin β1结合域。Importin α与Importin β结合后形成Importin α/β异源二聚体，再识别货物蛋白的NLS形成三聚体[8]。该三聚体通过NPC入核，从而完成经典的核转位过程。

2 核转位通路介导的出入核机制

2.1 浆蛋白入核

胞质-胞核转运通路(图1)。经典的核输入过程：Karyopherin α/β1异源二聚体形成后，Karyopherin α识别含有NLS序列的货物蛋白形成三聚体。该三聚体通过Karyopherin β1结合到NPC的胞质面并与Ran-GDP结合形成复合体，在转运因子NTF2和核孔蛋白等的协助下入核[9]。胞核内，在鸟苷酸交换因子RanGEF的作用下，Ran-GDP转换为Ran-GTP导致三聚体构象改变进而将靶蛋白和Karyopherin α释放到胞核。Karyopherin α再与胞核内其他Ran-GTP结合，被出核受体凋亡易感性蛋白(cellular apoptosis susceptibility，CAS)携带出核。剩下Karyopherin β1与Ran-GTP的二聚体通过核孔复合体回到细胞质。Ran-GTP在胞质中水解为RanGDP，而CAS再通过NPC入核，如此循环反复[10]。

图1 胞核-胞质转运通路示意图[11]Fig 1 Schematic diagram of nuclear-cytoplasmic translocation pathway

2.2 核蛋白出核

在胞核内，出核转运蛋白与含有NES的靶蛋白、Ran-GTP直接结合，形成出核转运蛋白-靶蛋白-RanGTP三聚体复合物，穿过NPC出核。在胞质中，Ran-GTP活化蛋白(Ran-GTPase activating protein，Ran-GAP)与Ran结合蛋白(RanBP1)结合，将Ran-GTP去磷酸化成为Ran-GDP，靶蛋白被释放。出核转运蛋白再经NPC再次入核，从而完成靶蛋白的核质转位[10,12]。CRM1(又叫XPO1)作为Karyopherin β家族中最主要的出核转运蛋白，介导超过200个核蛋白出核。更重要的是，它是几类重要的肿瘤相关蛋白唯一的出核转运载体，包括：1)肿瘤抑制蛋白，如P53、P73、Rb、APC和BRCA1等。2)细胞周期调控蛋白，如：p21、p27和Tob。3)免疫反应调节因子，如：NF-κB抑制因子，IκB。4)癌基因，如：BCR-ABL。

5)化疗靶点，如拓扑异构酶I和II[6]。因此，CRM1在肿瘤领域引起广泛关注，其与结直肠癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等肿瘤发生密切相关[13]。

3 核转位调控

3.1 蛋白出核抑制剂

目前蛋白出核抑制剂研究主要集中于CRM1，CRM1抑制剂能结合其Cys528残基，进而抑制其识别并结合含有NES区的靶蛋白。例如来普霉素B (Leptomycin B，LMB)，是第一个鉴定出来的CRM1特异性抑制剂，可与CRM1发生不可逆性结合，进而抑制CRM1介导的靶蛋白出核，但是因毒性较大而未能应用于临床患者[14]。一系列的出核特异性抑制剂(selective inhibitors of nuclear export，SINE)，即KPT类水溶性化合物，包括KPT-127、KPT-185、KPT-214、KPT-251、KPT-276、KPT-330(Selinexor)和KPT-335(Verdinexor)等。SINE能与CRM1的活性氨基酸Cys528发生加成反应，从而抑制CRM1介导的靶蛋白出核[13]。

3.2 蛋白入核抑制剂

Karyopherin β在多种肿瘤中高表达，而抑制其表达能显著诱导肿瘤细胞死亡；2016年Karyopherin β的特异性抑制剂INI-43[3-(1H-benzimidazol-2-yl)-1-(3-dimethylaminopropyl)被成功研发，通过抑制蛋白入核而发挥抗肿瘤效应[15]。芬维 A胺[N-(4-hydroxyphenyl)retinamide，4-HPR]能显著抑制多种肿瘤，而且具有较小的副作用，因此备受研究人员青睐。目前，4-HPR作为抗肿瘤药物已在多种肿瘤中开展I～II期临床实验，包括小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和恶性脑胶质瘤等[16]。

3.3 靶蛋白修饰

核转位对细胞生命活动的调节具有重要作用，因此其转位调控逐渐受到重视。近期研究主要集中在：对靶蛋白NLS区、NES区修饰，包括靶蛋白的磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化等，使靶蛋白滞留于胞质或胞核。例如：PFKFB3的乙酰化使其在胞质中蓄积，进而促进糖酵解，导致铂耐药[2]。Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)在多种肿瘤中高表达。YAP入核后能激活转录因子TEAD，促使下游癌基因转录和翻译，进而发挥促癌效应。Hippo信号通路能磷酸化YAP，使其滞留于胞质而抑制其活性，因而能够抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡[17]。

3.4 Ran的表达调控

Ran(a small nuclear GTP-binding protein)是Ras家族中的一员，是存在于真核细胞内的小分子GTP酶。货物蛋白的核质运输离不开Ran的协助。Ran在Ran-GTP和Ran-GDP两种构像之间改变。在胞核内Ran-GTP可以促使入核的靶蛋白从入核聚合物上解离下来，同时促进出核复合物形成。在胞质中Ran-GTP则是被水解为Ran-GDP。因而Ran-GTP存在胞核内浓度高浆内浓度低的分布特点，这种浓度的差异使核质转运更具方向性。倘若Ran表达发生改变，势必影响靶蛋白正常功能的发挥。

3.5 蛋白相互作用

调节蛋白的核质分布，除了通过直接调节出入核转运受体外，还可以通过与稳定存在于胞质或胞核蛋白的相互作用实现[18]。一个含有NLS的蛋白，不能正常的通过核转运的方式进入胞核。其中一个重要的原因在于其与稳定表达于胞质的蛋白紧密结合，这种结合将其NLS入核序列遮盖。同样，一个含有NES出核转运序列的蛋白滞留于胞核，也可能是由于与其他稳定表达于胞核的相互作用导致其出核障碍。例如：核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，主要在胞核内发挥作用，然而，当它在胞质内与Iκ-B结合时，NF-κB的NLS序列就会被遮盖，导致其不能入核，进而起到抑制肿瘤的作用[18]。

4 核转位与肿瘤

4.1 核转位与肿瘤的发生

肿瘤是一个基因的疾病，其发生的过程就是基因调控紊乱的过程，各种抑癌基因“不在其位而不谋其政”促使或加速了该过程的发生。其中比较经典的当属抑癌基因P53的出核转运了，该蛋白主要在胞核内通过转录调控来实现抑癌作用，而其出核转位直接影响了抑癌作用的发挥[19]。近年来，随着科学家们对核转位现象认识的逐渐加深，越来越多的核转位现象被发现，越来越多的肿瘤形成原因被揭露。值得注意的是，一些非癌基因或抑癌基因的的蛋白，由于核转位的发生，产生了新的功能作用，并在肿瘤的发生发展中起到了巨大的推动作用。例如，在DNA损伤压力下，胞质DNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)可以发生入核转运，并在核内通过抑制细胞的同源重组(homologous recombination，HR)修复使得基因组不稳定性增加，进而促进肿瘤的发生[20]。因此，在对肿瘤发生发展的认识上，不应该仅仅局限于基因的突变及蛋白量的改变上，充分意识到核转位的作用可以使人们对肿瘤的发生发展认识更加全面。

4.2 核转位与肿瘤的治疗

基因的核转位现象不仅在肿瘤的发生发展上占有举足轻重的地位，针对于该现象的研究在肿瘤治疗上也取得了令人振奋的成果。而目前针对于核质转位的治疗主要集中在以CRM1为代表的核转运蛋白上。例如，CRM1的抑制剂selinexor在治疗血液肿瘤上就取得了突破性进展[13]，该抑制剂不仅于2019年7月3日被美国食品和药物管理局(FDA)批准上市，更是被写进了NCCN指南。另外，在实体瘤的治疗上，核转运蛋白抑制剂也开始展露锋芒。对于Kras基因突变的肺癌，一直以来都是无药可靶向。而研究者却发现抑制XPO1的selinexor会杀死依赖于Kras基因的肺癌细胞，这项发现可能会为难治性肺癌打开新世界的大门[21]。当然，关于Selinexor的研究不仅仅限于血液肿瘤和肺癌，目前相关的临床试验已在妇科肿瘤、脑癌、前列腺癌和头颈癌等肿瘤中开展。相信在不久的将来，核转运蛋白抑制剂会为肿瘤的治疗史揭开新的篇章。

4.3 核转位与肿瘤的耐药

肿瘤的耐药是肿瘤的治疗过程中面临的一个巨大的挑战，而肿瘤耐药的发生也伴随了各种蛋白核转位现象的发生。包括代谢相关蛋白的核转位[2]、氧化还原相关蛋白核转位[22]等，这些蛋白或基因的异常核质定位从多个角度影响了化疗药物的敏感性。更加值得注意的是，核转位现象不仅发生在化疗药耐药，同样与靶向治疗的耐药也息息相关。例如，核蛋白激酶Cδ(PKCδ)作为多个已知TKI抗性机制共同轴，其核定位是TKI耐药必须的，而TKI灭活的EGFR与涉及TKI抗性的其他膜受体二聚化可促进PKCδ核转位，进而促使TKI耐药的发生[23]。可以说核转位现象已经渗入到肿瘤耐药机制的方方面面。

5 问题与展望

肿瘤是基因的疾病，核转位是基因异常表达的重要原因。目前针对基因的研究中，靶向基因的突变和过表达的药已经使肿瘤治疗得到了质的飞跃。而核转位作为肿瘤中更为普遍的现象，发生在肿瘤的各阶段，并参与各种生物学行为，与肿瘤的治疗和耐药息息相关。因此，靶向核转位的治疗存在着巨大的潜力，未来必将在肿瘤的治疗史上留下浓墨重彩的一笔。然而，核转位通路参与因素众多、调控因子复杂，各因素间相互协同、制约，很难做到精准靶向。目前针对于核转运蛋白的抑制剂虽然能改变蛋白的核质定位，但无法做到某一蛋白定位的精准改变，这就造成了副作用大等弊端。但是，随着对核质转位研究的不断深入，以及基因技术的不断成熟，高效性、特异性和低毒性的核转位抑制剂有望成为恶性肿瘤的治疗靶点。