GC-MS结合保留指数分析轮钟花果实的挥发性成分

王建霞，郭洪伟，刘一涵，田云刚，李 明，毕绍文，魏 华，2

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首416000；2.湖南省土家医药研究中心，湖南吉首416000；3.曲靖市沾益区万远中药材种植农民专业合作社，云南曲靖655000)

轮钟花(Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz)，别名野灵果、肉算盘等，系桔梗科(Campanulaceae)轮钟花属(Cyclocodon)多年生草本植物，根可入药，无毒，有益气补虚、祛瘀止痛之效[1-2].现轮钟花不断得到开发利用，在云南曲靖、湘西和四川等地开始人工种植，以其果实销售于市场.轮钟花果实可食用，成熟时紫黑色，浆果球状，富含原花青素、果胶和多糖等，具有较强的抗氧化作用[3-6]，可作为饮料和休闲食品的原材料，具较好的发展空间.轮钟花化学成分研究基础薄弱，仅试剂反应显示果实中主要含糖类、生物碱、黄酮、酚类、甾体、蒽醌类、三萜类和有机酸[7]，亟需深入研究.而挥发性成分的研究对果实的风味品质评价十分重要，因此，本研究选择水蒸气蒸馏法、索式提取法及超声辅助萃取法提取轮钟花果实挥发性成分，采用GC-MS分析技术，并结合保留指数(Retention index，RI)定性分析果实的挥发性成分，以期为轮钟花果实研究分析和深度开发利用提供参考.

1 仪器与材料

岛津GCMS-QP2010(日本岛津公司)；步琪Rotavapor R-210旋转蒸发仪(瑞士步琪公司)；中药材粉粹机(永康市铂欧五金制品有限公司)；梅特勒-托利多LE204E分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；昆山舒美超声仪KQ-250DE(昆山市超声仪器有限公司)；KDM型调温电热套 (山东鄄城光明仪器有限公司).

正构烷烃混合对照品C7-C40(产品编号:CDAA-M-690038-HC-1 mL，上海安谱实验科技股份有限公司)；蒸馏水；正己烷、石油醚(沸程30～60℃)、石油醚(沸程60～90℃)(天津市富宇精细化工有限公司)；无水硫酸钠(天津市科密欧化学试剂有限公司)；所用试剂为分析纯.

轮钟花于2018年12月采自云南省曲靖市沾益区炎方乡小古山村，由毕邵文先生提供，经吉首大学张代贵教授鉴定为桔梗科轮钟花属植物轮钟花Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz的果实，凭证标本(JIU.WU20181201)存于湖南省土家医药研究中心.果实于烘箱45℃烘干，粉碎后，过二号筛备用.

2 方法

2.1 水蒸气蒸馏法提取

准确称量轮钟花果实粉末10 g置1 000 mL圆底蒸馏瓶中，加入300 mL蒸馏水和玻璃珠数粒，隔夜浸泡.连续提取8 h至挥发油量不再增加后，收集馏液，置于分液漏斗，使用正己烷萃取3次，萃取液加适量无水硫酸钠脱水后，40℃减压浓缩，得少许贴于瓶壁上的淡色物质，精密称重，计算轮钟花果实得油率.

2.2 索式提取法提取

准确称量轮钟花果实粉末10 g置滤纸筒，包实放入索式提取管中，提取管上接冷凝管，下接装有100 mL石油醚(沸程30～60℃)的250 mL三角瓶.置于40℃水浴锅回流提取4 h，提取完将三角瓶中收集液40℃减压浓缩，得少许浅黄色油状物，精密称重，计算轮钟花果实得油率.

2.3 超声辅助萃取法提取

准确称量轮钟花果实粉末10 g置250 mL三角瓶中，按料液比1∶10加入石油醚(沸程60-90℃)，超声频率40 kHz，超声功率250 W，于40℃超声仪内超声30 min，提取2次.完成后抽滤收集滤液，于40℃减压浓缩，得少许浅黄色油状物，精密称重，计算轮钟花果实得油率.

2.4 GC-MS分析条件

色谱条件:SH-Rtx-5MS气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为高纯氦气(纯度 ＞ 99.99%)，载气流量 1 mL/min，进样量 1.0 μL，进样口温度250.0℃，分流比20∶1，程序升温为:初始温度为100.0℃，以5.00℃/min的速率升温至200℃，保持5 min，再以6℃/min的速率升温至280℃，保持20 min；溶剂延迟时间为3 min.质谱条件:离子源为EI源，电子能量为70 eV，质量扫描范围为m/z50～600 amu，离子源温度为230℃.

2.5 保留指数的测定

取正构烷烃混合对照品(C7-C40)0.1 mL溶1 mL正己烷中，取适量过膜备用，按照2.4项的色谱条件进行分析，记录保留时间，运用单一线性升温公式(1)来计算各待测化合物的保留指数RI[8].

式中，RI代表保留指数，tr代表保留时间，x表示待分析的化合物，n和n+1分别表示正构烷烃的碳原子数，且tr(n)＜tr(x)＜tr(n+1).

3 结果

3.1 挥发油得油率

水蒸气蒸馏法、索氏提取法、超声辅助萃取法提取长叶轮钟草果实挥发油的得率(w/w)分别是1.24%、4.61%和5.43%.

3.2 GC-MS结合保留指数分析结果

按上述GC-MS条件测定，3种方法提取轮钟花果实挥发性成分的总离子流图(TIC图)如图1所示，采用峰面积归一化法分析，得出各组分在样品中的质量分数.依据NIST14s.lib标准谱库检索，人工谱库解析，从匹配度、质谱图相似度等方面进行比较，取上述公式(1)计算待测组分的RI，并与网站(http://webbook.nist.gov/chemistry/)和NIST14s.lib标准谱库中RI*文献值对比进行定性，选出最适匹配化合物.

图1 轮钟花果实挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile constituents from fruits of Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz

轮钟花果实的挥发性成分以酸类、烃类、酯类和醇类为主，如表1、图2所示.果实挥发性成分共确定64种化合物，三种提取方法检测到共同成分为9种.其中，水蒸气蒸馏法、索式提取法和超声辅助萃取法各确定31、38和34种化合物，挥发性成分各占样品总质量分数的88.74%、97.03%和99.14%.

由表1可知，果实水蒸气蒸馏提取物挥发性组分中占样品质量分数在3%以上的有6种，共占样品总质量分数的53.18%.十九烷(20.09%)质量分数占比最高，其次为正二十一烷(19.67%)、2，6，10，15-tetramethylheptadecane(3.88%)、三十一烷(3.27%)、Butyl 9，12，15-octadecatrienoate(3.19%)和二十五烷(3.08%).索氏提取物挥发性组分中占样品质量在3%以上的有4种，共占样品总质量分数的66.86%.亚油酸(45.13%)质量分数占比最高，其次为棕榈酸(8.67%)、反油酸(7.15%)和 Chondrillasterol(5.91%).超声提取物挥发性组分中占样品质量分数在3%以上的有5种，共占样品总质量分数的79.89%.(Z)-18-Octadec-9-enolide(28.73%)质量分数占比最高，其次为亚油酸(24.59%)、棕榈酸(10.50%)、油酸(8.74%)和植物甾醇(7.33%).

表1 轮钟花果实挥发性成分Table 1 Volatile constituents in fruits of Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz

注:RI通过实验结果计算获得；RI*通过http://webbook.nist.gov/chemistry/或NIST14s.lib谱库检索获得；“-”代表无或未检出.Note:RI is obtained by the calculation of experiment；RI*is obtained by http://webbook.nist.gov/chemistry/or NIST14s.lib；“ -” represents no or not detected.

图2 轮钟花果实挥发性成分类别比较Fig.2 Classification comparison of volatile components from fruits of Cyclocodon lancifolius(Roxburgh)Kurz

4 讨论与结论

GC-MS与保留指数配合定性挥发性成分已是比较认可的方法，其结果具有一定的全面性和准确性，在食品、烟草、香精香料等中广泛应用[9-12].水蒸气蒸馏法、索式提取法和超声辅助萃取法因提取原理不一样，所提取出挥发性成分得量和种类也有较大不同，3种方法相互结合，可较充分提取出样品中的挥发性成分.果实中含大量的亚油酸，索氏提取法和超声辅助萃取法提取出亚油酸较多，分别为45.13%和24.59%，而水蒸气蒸馏法却检测到亚油酸较少，为0.91%，可能是提取原理不同或实验操作等造成.亚油酸作为人体必需脂肪酸和重要的多不饱和脂肪酸，日常需求极高，具有抗粥状动脉硬化和增强肌体免疫能力等作用[13，14].

笔者测得轮钟花果实的挥发性成分与蒋寒林等[15]报道的轮钟花果实挥发性成分有一定的差异，文献所报道的果实挥发性成分主要为烃类、酸类、酯类和醇类，基本与本研究结果相符；同样是使用3种相同的提取方法，两者检测得出相同成分仅20余种，且成分的种类和含量也有较大不同，究其原因可能是果实的采摘时间、保存方式、分析仪器和检索方式等不同所致.

本研究选用3种提取方法，采用GC-MS分析，并结合保留指数定性分析轮钟花果实挥发性成分.鉴定出果实64种挥发性成分，以酸类、烃类、酯类和醇类为主，研究结果可为轮钟花果实进一步开发利用提供依据.