五味子糖浆中6 种抑菌剂筛查与分析

肖 引，王 皎，陈 江△

（1. 武警陕西省总队医院临床药学室，陕西 西安 710054； 2. 西安国际医学中心，陕西 西安 710077）

五味子糖浆收载于2015年版《中国药典（一部）》，具有益气生津、补肾宁心功效。其制法为取五味子粉碎成粗粉，取100 g，用30%乙醇浸渍72 h 后，缓缓渗漉，收集渗漉液至相当于原药材的2 倍，滤过；另取蔗糖600 g，制成糖浆，加入上述滤液中，再加入苯甲酸钠及桔子香精适量，混匀，加水调至1 000 mL［1］。制法显示，五味子糖浆仅使用苯甲酸钠作为抑菌剂。参考文献［2-3］报道的高效液相色谱（HPLC）法，本研究中筛查了3 家不同企业10 批样品中抑菌剂的使用情况。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BS224S 型电子分析天平（德国塞多利斯公司，精度为0.1 mg）；BP211D 型电子分析天平（德国塞多利斯公司，精度为0.1 mg）；AE 240 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度为0.1 mg）；Shimadzu LC 2030 3D型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Empower 色谱工作站（美国Waters 公司）；KQ0500-DE 型数控超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司，功率为200 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

苯甲酸对照品（批号为100419-201703，含量为99.9%），山梨酸对照品（批号为190126-201501，含量为99.6% ），对羟基苯甲酸甲酯对照品（批号为100278-201705，含量为100%），对羟基苯甲酸丙酯对照品（批号为100444-201403，含量为99.6%），对羟基苯甲酸丁酯对照品（批号为110792-200503，含量为100%），均由中国食品药品检定研究院提供；对羟基苯甲酸乙酯对照品（德国Ehrenstorfer Quality，批号为G128088，含量为99.0% ）；10 批五味子糖浆（市售品，编号为S1 ～S10）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：含0.02 mol / L 乙酸铵的0.08%冰醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱程度见表1；检测波长：255 nm。理论板数按对羟基苯甲酸乙酯峰计应不低于4 000。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

精密量取样品5 mL，置25 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声处理15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。取苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.05 mg 的混合溶液，作为对照品溶液。精密量取自制苯甲酸阴性五味子糖浆5 mL，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下3 种溶液，按拟订色谱条件各进样5 μL，记录色谱图。阴性对照品溶液色谱中，在与苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯混合对照品溶液色谱相应位置上无相应色谱峰。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取苯甲酸9.89 mg、山梨酸8.50 mg、对羟基苯甲酸甲酯9.01 mg、对羟基苯甲酸乙酯9.06 mg、对羟基苯甲酸丙酯10.41mg、对羟基苯甲酸丁酯10.26mg，精密称定，分别置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，作为贮备溶液，将贮备溶液稀释成质量浓度分别为0.197 80，0.034 00，0.036 04，0.036 24，0.041 64，0.041 04 mg/mL 的混合标准溶液，分别精密吸取2，6，10，15，20，25 μL 注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件进样分析，记录其峰面积，以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的回归方程分别为Y苯=437 838.2X苯（r=0.999 9），Y山=10 889 020X山（r=0.999 8），Y甲酯=5 201 898X甲酯（r=0.999 9）、Y乙酯=4 837 995X乙酯（r=0.999 8）、Y丙酯=4 414 243X丙酯（r=0.999 8）、Y丁酯=4 129 725X丁酯（r=0.999 8）。结果表明，苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯进样量分别在0.396 ～4.945 μg，0.068 ～8.50 μg，0.0721 ～0.901 μg，0.0725 ～0.906 μg，0.083 28 ～1.041 μg，0.082 08 ～1.026 μg 范围内与各峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液5 μL，重复进样6 次，记录各组分的峰面积。结果的RSD在0.28% ～0.36%（n=6）范围内，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录苯甲酸和对羟基苯甲酸乙酯的峰面积。结果的RSD分别为0.23%和0.26%（n=6），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为170201）样品，平行量取6 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果样品中苯甲酸的平均含量为1.475 mg / mL、RSD为1.80% （n=6），对羟基苯甲酸乙酯的含量为0.425 mg/mL、RSD为1.79% （n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批（批号为170201）样品，精密量取6 份，每份2.5 mL，分别置容量瓶中，再各精密加入混合对照品溶液5 mL（苯甲酸质量浓度为0.739 6 mg/mL，山梨酸质量浓度为1.244 mg / mL、对羟基苯甲酸甲酯质量浓度为0.463 6 mg / mL，对羟基苯甲酸乙酯质量浓度为0.200 2 mg / mL，对羟基苯甲酸丙酯质量浓度为0.474 mg/mL，对羟基苯甲酸丁酯质量浓度为0.418 4 mg/mL），依法制备供试品溶液，精密吸取5 μL，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（ n=6）

表3 10 批样品抑菌剂含量测定结果（mg/mL）

2.4 样品含量测定

取10 批五味子糖浆，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，计算苯甲酸及对羟基苯甲酸乙酯的含量。结果见表3。

3 讨论

防腐剂有苯甲酸、山梨酸、尼铂金类、苯扎氯铵类等，在多数情况下是安全的，但选择不当或超剂量使用会产生不良反应，危害人体健康［4-5］。2015年版《中国药典（四部）》规定了糖浆剂中添加防腐剂含量：山梨酸和苯甲酸的用量不得超过0.3% （其钾盐、钠盐的用量分别按酸计），羟苯酯类的用量不得超过0.05%［6］。苯甲酸抑菌剂对细菌的最适pH 为2.5 ～4.0。分子态苯甲酸的抑菌活性较离子态高，在pH ＜4 时，完全抑制的最低浓度为0.05% ～0.1%；当pH ＞6 时，抑菌活性显著降低。对羟基苯甲酸酯即尼泊金酯是国际公认的广谱性高效安全的食品防腐剂，广泛用于食品、化妆品及医药等行业［7-9］。

结合文献［10-15］，本研究中建立了五味子糖浆抑菌剂的筛查方法。10 批样品的苯甲酸含量差异不同，较低含量可能原因为糖浆剂长期放置过程中部分抑菌剂存在降解，试验结果为企业添加防腐剂限量提供了参考意义。

尼泊金酯类（对羟甲基苯甲酸乙酯）防腐剂对霉菌、酵母菌和细菌有广泛的抗菌作用，该防腐剂的作用在于未电离分子发挥抗菌活性，抑制微生物细胞的呼吸酶系与电子传递酶系的活性，以及破坏微生物的细胞膜结构；且随着烷链的增加抗菌效力增强，适用于中性溶液的防腐。但通过检测10 批样品的pH，测定结果均在2.58 ～3.79 之间，表明五味子糖浆使用苯甲酸抑菌剂具有合理性。但没有必要再使用对羟甲基苯甲酸乙酯防腐剂，且存在擅自改变工艺添加抑菌剂的风险。