Vanin-1作为对乙酰氨基酚致急性肝损伤早期评价标志物的相关性分析

甄丽影

对乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol, paracetamol, APAP)是一种非甾体类消炎药。使用高剂量APAP时，其代谢物可引起肝毒性[1]。此外，在美国已有报道称，过量使用APAP导致急性肝衰竭[2]。长期以来，谷丙转氨酶(ALT)被用作检测药物性肝损伤的金标准。然而据报道，ALT在糖尿病[3]、心肌梗死[4]等情况下同样会升高，缺乏特异性。因此，我们迫切需要寻找合适的生物标志物预测APAP所致急性肝损伤的早期不良反应。

泛酰巯基乙胺酶(Vanin-1)是一种上皮细胞糖基化磷脂酰肌醇锚定的水解酶，在肝脏、肠道和肾脏中高表达[5]。经研究发现，尿液Vanin-1是药物致急性肾损伤的早期诊断标志物，且敏感性较高[6]。在肝脏疾病中，有研究证实高脂饮食小鼠的Vanin-1 mRNA表达量增加[7]，另有报道称Vanin-1基因可能在安妥明介导的保肝作用中发挥作用[8]。然而目前尚无关于APAP诱导急性肝损伤和Vanin-1表达变化的报道。本研究旨在建立APAP诱导急性肝损伤小鼠模型，检测小鼠血清Vanin-1、ALT表达变化，分析其相关性，并进一步探讨Vanin-1作为APAP致急性肝损伤早期评估标志物的可能性。

资料与方法

一、动物与试剂

健康SPF级雄性C57BL/6雄性小鼠(8周龄)48只，购自常州卡文斯实验动物有限公司。动物饲养条件为：环境温度22±2℃，湿度60%～80%，循环光照(12h明暗交替)，自由饮水和进食，动物适应环境1周后开始实验操作，处理前禁食20 h。APAP购自东和药品有限公司(日本)，TRIzol裂解液、BCA蛋白浓度测定液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(美国)，PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit及SYBR Premix Ex Taq购自宝日医生物技术(北京)有限公司(日本)，实时荧光定量PCR引物由上海生物化工有限公司代为设计生产，Vanin-1 ELISA试剂盒购自艾博抗(上海)贸易有限公司(英国)。

二、实验方法

(一)小鼠急性肝损伤模型的制备 小鼠随机分为4组(每组n=32)：对照(Control)组、100 mg/kg APAP处理组、200 mg/kg APAP处理组、300 mg/kg APAP处理组。APAP处理组小鼠经腹腔注射给药，对照组相同方式给予0.9%生理盐水。分别在APAP处理后0、4、8、12、16、24、36、48 h时处理经尾静脉采血(每个时间点n=4)，5 000 g 25 ℃离心10 min，收集血清检测ALT及Vanin-1 mRNA，处死小鼠留取肝脏组织供酶联免疫吸附实验(ELISA)检测Vanin-1蛋白表达。

(二)qRT-PCR测血清 Vanin-1 mRNA表达变化 TRIzol法提取血清Vanin-1 mRNA，260 nm波长下测得mRNA浓度，根据试剂说明书将mRNA逆转录为cDNA，使用SYBR Green扩增目的基因，β-acti作为内参基因，计算Vanin-1 mRNA的相对表达变化，引物序列如下：Vanin-1 Forward(5′-3′) AAC-TGGATACCCTGTGATAACCC，Reverse(5′-3′) GTCTCCCATGTTCGCCACAA；β-actin Forward (5′-3′) GTGACGTTGACATCCGTAAAGA，Reverse(5′-3′) GCCGGACTCATCGTACTCC。

(三)ELISA法测肝组织Vanin-1蛋白表达变化 裂解小鼠肝脏组织获得蛋白样本，使用BCA蛋白检测试剂盒定量蛋白浓度，每孔加入25 μg 蛋白进行ELISA测定。

结 果

一、APAP急性肝损伤模型建立

给予小鼠腹腔注射不同浓度APAP(100、200、300 mg/kg)，并在12 h检测血清ALT及Vanin-1 mRNA水平。如表1所示，发现与对照组相比，100 mg/kg APAP给药浓度引起ALT(P<0.001)及Vanin-1 mRNA(P<0.001)水平不同程度增加，200 mg/kg时两者水平较100 mg/kg持续升高(P<0.05)，并达到平台期，200 mg/kg与300 mg/kg的给药浓度引起的ALT及Vanin-1 mRNA上调水平无差异(P>0.05)。此外，如图1所示，Pearson相关系数示ALT与Vanin-1 mRNA表达水平具有相关性，相关系数R为0.918(P<0.001)。

表1 四组小鼠APAP处理12 h后的ALT及Vanin-1 mRNA水平 (±SD)

图1 Pearson相关系数评价ALT活性与Vanin-1 mRNA表达的相关性

二、300 mg/kg APAP处理下，小鼠血清ALT及Vanin-1 mRNA表达水平变化

如图2所示，分别在给药300 mg/kg APAP后0、4、8、12、16、24、36、48 h测定血清ALT活性和Vanin-1 mRNA表达。发现给药后8 h ALT活性升高，16 h时到达峰值，然后逐渐降低。而Vanin-1则在给药后4 h开始明显升高，12 h达到峰值，并在48 h前迅速下降至峰值的50%。与ALT活性相比，Vanin-1的表达差异较大。

图2 给药300 mg/kg APAP后不同时间点的ALT活性(A)和Vanin-1 mRNA(B)表达变化

三、小鼠肝脏Vanin-1蛋白表达变化

如图3所示，300 mg/kg APAP处理条件下，小鼠肝脏Vanin-1蛋白表达水平在4 h时增高，8 h时到达峰值，随后逐渐下降。肝脏Vanin-1蛋白表达与血清表达变化规律一致，但到达高峰时间早于血清。

图3 小鼠肝组织Vanin-1表达水平变化(ng/mg)

讨 论

本研究结果显示，与对照组相比，APAP处理组小鼠的Vanin-1表达显著上调，且表达变化早于ALT，提示Vanin-1在监测APAP引起的早期急性肝损伤方面具有潜在的应用价值。

Vanin-1是调节谷胱甘肽(GSH)对上皮细胞氧化损伤依赖性反应的关键分子[9]。Hosohata等通过建立大鼠单侧输尿管梗阻，发现在术后第7天，当肾小管组织病理学损伤明显时，肾盂尿中Vanin-1水平明显高于假手术组[10]，提示尿Vanin-1可能作为肾小管损伤的潜在生物标志物。另外，Heiko Hosohata同样在药源性急性肾损伤大鼠模型尿液中检测到Vanin-1水平升高，且其变化早于其他生物学标志物如NGAL、Kim-1等[6]。目前尚无关于Vanin-1与APAP致急性肝损伤的研究数据，我们给小鼠腹腔注射不同浓度APAP构建药物诱导性急性肝损伤模型，通过检测血清及蛋白Vanin-1表达水平，发现随造模时间延长，血清及蛋白Vanin-1表达均呈先上升后下降趋势，肝脏下降趋势早于血清，这可能是由于肝脏代谢较血液更为快速。另外，血清Vanin-1 mRNA在小鼠肝脏发生急性肝损伤后的表达变化与ALT呈相关性，提示我们Vanin-1有作为肝损伤早期标志物的潜力，值得注意的是，血清Vanin-1表达水平变化早于ALT，这意味着Vanin-1比ALT在评估APAP致急性肝损伤中更具敏感性，其中具体机制和评估效果仍需分别在基础和临床实验中进一步探究。