舒洛地特对子痫前期孕期血清诱导内皮受损的保护作用

陶燕燕，梁国庆，蔡 伟，王晓静，张 芯，牛秀珑，陈少伯

0 引 言

舒洛地特是一种高纯度多组分糖胺聚糖类药物，其中移动肝素即低分子肝素占80%，硫酸皮肤素占20%，主要适用于有血栓形成危险的血管疾病[1-3]。已报道舒洛地特可通过抗氧化[4-5]、抗炎[5]、抗凋亡[6]等机制保护血管内皮功能，目前已在糖尿病肾病[7]、血栓疾病和缺血再灌注损伤等领域广泛应用。有研究发现，舒洛地特的主要成分——低分子肝素已经在妊娠高血压疾病的临床预防性治疗中表现出良好的有效性[8-9]。妊娠高血压疾病的临床类型包括妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性高血压并发子痫前期以及慢性高血压等[10]，其中约50%的妊娠期高血压可在孕中晚期发展成子痫前期[11]，且引起血管内皮损伤的相关促发因素于孕早期就已出现。基于上述，本研究拟用孕12周患者子痫前期血清(preeclampsia pregnant women serum,PES)干预人脐静脉内皮细胞，以模拟孕期局部病理微环境，并观察舒洛地特对PES干预下内皮细胞增殖和管腔形成能力的调节作用，旨在为舒洛地特参与妊娠高血压疾病的早期预防提供更多的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料收集2019年1月至6月武警部队特色医学中心妇产科20份孕12周正常产妇血清(normal pregnant women serum, NPS)样本和20份孕12周PES样本，由本实验室生物样本库收集冻存。2组血清样本内皮功能相关因子的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。人脐静脉内皮细胞HUVEC为本实验室留种冻存，Ea.hy926人脐静脉融合细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司，舒洛地特(意大利阿尔法韦士曼制药公司，2 mL:600 LSU/支)，DMEM培养基、PBS缓冲液、0.25% 胰蛋白酶(天津秀祥生物科技有限公司)，进口胎牛血清(天津普瑞思生物科技有限公司，品牌ExCell Bio，货号FND500)，CCK-8试剂盒(碧云天试剂，货号C0038)，sFLT-1 ELISA kit和PlGF ELISA kit(天津普瑞思生物科技有限公司，品牌R&D，货号DVR100C、DPG00)， Matrigel基质胶(天津秀祥生物科技有限公司，品牌Corning，货号 354234)。本研究已获得医院伦理委员会批准(批件号：PJHEC-2015-A1)，研究对象均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养常规方法复苏HUVEC和Ea.hy926细胞株，分别采用含10%进口胎牛血清(FBS)的DMEM低糖和DMEM高糖培养基于37 ℃、5%CO2条件下进行培养，根据细胞具体生长情况换液或传代，取对数期细胞进行试验。舒洛地特的溶解方式为：以等渗盐水按比例配成0、1、3、10、30、100、300 LSU/mL工作液。

1.2.2 CCK8法检测细胞增殖活性HUVEC 和Ea.hy926细胞经消化、计数，以每孔6000个铺入96孔板中，培养4 h后更换为含5% FBS的新鲜培养基继续培养12 h后换液，将舒洛地特按不同浓度分为7组，每组5复孔，各孔分别加入10 μL 不同浓度舒洛地特(或等体积对照溶剂等渗盐水)和90 μL含5%FBS的培养基，使舒洛地特终浓度分别为：0、0.1、0.3、1、3、10、30 LSU/mL，继续培养24 h；弃培养基，每孔加入100 μL以无血清培养基稀释10倍的CCK8，继续培养2 h测定A450nm吸光度，参比波长A650nm。

1.2.3 Matrigel法检测细胞管腔形成能力将分装冻存的基质胶提前置于4 ℃融化至液态，96孔板中每孔铺胶50 μL，置于37 ℃培养箱中孵育30 min以上，消化、计数细胞，以HUVEC每孔2×104个、Ea.hy926每孔4×104个、每孔100 μL细胞悬液进行铺板，分为6组，每组3复孔，37 ℃ 5% CO2培养4 h后换液，每孔加入10 μL不同浓度的舒洛地特(或对照溶剂等渗盐水)和90 μL含10%FBS的新鲜培养基，使舒洛地特终浓度为：0、0.1、0.3、1、3、10 LSU/mL，继续培养6 h后置于倒置显微镜40×或100×视野下，计数管腔形成数量。

1.2.4 Matrigel法检测管腔形成能力按1.2.3所述融化基质胶至液态，24孔板中每孔铺胶250 μL，置于37 ℃培养箱中孵育30 min以上； HUVEC每孔10×104个，Ea.hy926每孔20×104个， 37 ℃ 5% CO2培养4 h后换液，按使用的不同病理生理血清和不同浓度舒洛地特干预将细胞分为7组：对照组(胎牛血清+NaCl)、NPS组(NPS+NaCl)、NPS+0.3 LSU/mL舒洛地特组、NPS+10 LSU/mL舒洛地特组、PES组(PES+NaCl)、PES+0.3 LSU/mL舒洛地特组、PES+10 LSU/mL舒洛地特组。每组3复孔，各孔分别加入50 μL 舒洛地特或等体积等渗盐水和450 μL含10%病理或生理血清的新鲜培养基，拍板混匀，Matrigel法观察管腔形成情况。

1.2.5 ELISA法检测细胞培养上清液中sFLT-1和PlGF的分泌水平按1.2.4所述消化、计数、铺板、分组及干预，NPS、PES及不同浓度舒洛地特干预6 h后每孔取细胞上清液300 μL，1500 r/min，离心5 min，离心半径5 cm，将上清液分装冻存于-70 ℃冰箱或立即参照ELISA试剂盒说明书检测可溶性血管内皮生长因子受体-1(soluble fms-like tyrosine kinase receptor 1,s Flt-1)和胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)的分泌水平。

2 结 果

2.1 舒洛地特对人脐静脉内皮细胞的增殖影响CCK-8比色法结果显示，在HUVEC细胞中，与0 LSU/mL吸光度比较，其他各浓度差异无统计学意义(P=0.30)，提示舒洛地特不影响HUVEC细胞的增殖水平。但在Ea.hy926细胞中，与0 LSU/mL舒洛地特吸光度比较，10、30 LSU/mL 舒洛地特的吸光度明显下降(P<0.05)，说明10 LSU/mL和30LSU/mL舒洛地特均可不同程度抑制细胞增殖。以上结果提示低浓度舒洛地特对内皮细胞的增殖活性无促进作用，高浓度舒洛地特反而会抑制细胞增殖。见表1。

表 1 不同浓度舒洛地特对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

2.2 舒洛地特对人脐静脉内皮细胞的管腔形成能力影响0.1、0.3、1、3 LSU/mL舒洛地特均能促进HUVEC细胞管腔形成。与0 LSU/mL舒洛地特管腔形成能力比较，0.3 LSU/mL舒洛地特促进管腔形成作用显著上调(P=0.00)，但当舒洛地特浓度超过0.3 LSU/mL时，其促进管腔形成作用逐渐下调，且10 LSU/mL舒洛地特促进管腔形成作用最小(P=0.02)。在Ea.hy926融合细胞中，0.3LSU/ml 舒洛地特促进管腔形成能力较0 LSU/mL显著上调(P=0.001)，当舒洛地特浓度继续增大时其促进管腔形成作用逐渐下调，10 LSU/mL舒洛地特对管腔形成能力无促进作用(P=0.50)。见表2，图1。

表 2 舒洛地特对人脐静脉内皮细胞的管腔形成数量的影响个/视野，n=6)

图示0.3 LSU/mL舒洛地特促进管腔形成作用显著高于其他浓度

2.3 舒洛地特对PES诱导下内皮细胞管腔形成能力的保护作用在HUVEC细胞中，PES组管腔形成数量较NPS组、PES+0.3 LSU/mL舒洛地特组明显降低(P<0.01)，较PES +10 LSU/mL舒洛地特组明显升高(P<0.01)。在Ea.hy926细胞中，PES+0.3 LSU/mL舒洛地特组管腔形成数量较PES组明显升高(P<0.01)；NPS+0.3 LSU/mL舒洛地特组较NPS组明显升高(P<0.01)，NPS+10 LSU/mL舒洛地特组、PES组较NPS组明显降低(P<0.01)。见表3。上述结果提示，PES可损伤内皮细胞的成管活性，0.3 LSU/mL 舒洛地特可对PES诱导的内皮细胞成管受损产生保护作用，但10 LSU/mL 舒洛地特则无此作用，且会加剧PES对内皮细胞的损伤。见图2。

表 3 舒洛地特对子痫前期病理血清诱导下内皮细胞管腔形成数量影响个/视野)

图示0.3 LSU/mL舒洛地特可显著上调内皮细胞管腔形成能力

2.4 舒洛地特对内皮细胞sFLT-1和PlGF的分泌影响在HUVEC、Ea.hy926细胞中，NPS+0.3 LSU/mL 舒洛地特组sFLT-1表达量较NPS组明显降低(P<0.01)，PlGF表达量较NPS组明显升高(P<0.01)；PES组sFLT-1表达量较NPS组、PES+0.3 LSU/mL舒洛地特组明显升高(P<0.01)。在Ea.hy926融合细胞中，PES组PlGF表达量较PES+0.3 LSU/mL舒洛地特组明显降低(P<0.01)。见表4。

表 4 舒洛地特对sFLT-1和PlGF的分泌水平影响

以上结果提示，子痫前期病理血清可上调内皮细胞sFLT-1的分泌、抑制PlGF的分泌，而0.3 LSU/mL 舒洛地特可改善子痫前期病理血清对sFLT-1的促分泌以及对PlGF的抑制分泌作用。

3 讨 论

糖胺聚糖类药物舒洛地特可保护内皮功能，包括通过PI3K/Akt信号通路抵抗氧化应激[12]，通过调控ET-1、VEGF等内皮功能相关因子的分泌和凋亡等机制改善缺血缺氧[13]，通过抑制炎性因子/趋化因子的释放抵抗内皮损伤等[14]。研究证实舒洛地特的主要成分—低分子肝素能有效改善子痫前期，有助于防治子痫前期等病症[15]。因此，本研究探讨舒洛地特是否对人脐静脉内皮细胞具有保护作用，以及是否能够抵抗子痫前期病理血清对内皮细胞造成的损伤。

血管生成涉及内皮细胞活化、增殖、迁移、管腔形成及血管生成相关因子的分泌等，其中内皮细胞的增殖和管腔形成能力是细胞参与血管形成及维持血管形态的两大重要特点[16]，本研究使用孕期生理和病理血清处理内皮细胞，分别模拟正常孕期和子痫前期孕期胎盘微环境，结果表明低浓度舒洛地特对内皮细胞增殖活性无显著影响，而高浓度10 LSU/mL 舒洛地特能显著抑制细胞增殖，说明低浓度舒洛地特对子痫前期无改善作用，高浓度舒洛地特反而会加剧子痫前期病情。但不同浓度舒洛地特对内皮细胞管腔形成能力调节的效果不同，其中，0.3 LSU/mL 舒洛地特上调HUVEC和Ea.hy926细胞的管腔形成能力最强。与NPS相比，PES干预显著下调内皮细胞的管腔形成能力，说明子痫前期病理血清损伤内皮细胞成管活性，也间接印证了子痫前期患者胎盘血氧供应不足。0.3 LSU/mL 舒洛地特干预能显著上调HUVEC和Ea.hy926细胞的管腔形成能力，在一定程度上逆转PES带来的病理损伤，说明0.3 LSU/mL 舒洛地特有助于改善子痫前期。本研究中0.3 LSU/mL 舒洛地特不调控增殖，但能改善管腔形成和胎盘血管生成相关因子的表达，因此舒洛地特可能通过干预管腔形成和胎盘血管生成相关因子的表达途径来调控血管生成，而并非通过调控增殖途径。

sFLT-1主要由胎盘产生，能竞争性结合VEGF，抑制血管再生，影响胎盘血流供应，子痫前期患者胎盘异常导致sFLT-1异常高表达，加剧了胎盘缺血。PlGF属于VEGF家族，在胎盘局部表达，生物学功能为促进内皮细胞增殖、迁移、促进血管新生，增加血管通透性。有研究表明子痫前期患者血清中sFLT-1表达上调，PlGF表达下调[17-18]，与正常妊娠者相比，有不良产科结局妇女的sFLT-1/PlGF比值显著上调，并且在整个妊娠期间呈上升趋势[19]，因此sFLT-1和PlGF的异常表达及两者比值对子痫前期具有高度预测性。本研究结果表明，与正常孕妇血清相比，PES干预可上调sFLT-1以及下调PlGF的分泌水平，而0.3 LSU/mL 舒洛地特能显著下调sFLT-1以及上调PlGF的分泌水平，逆转子痫前期病理血清对sFLT-1和PlGF表达的调控，说明此浓度舒洛地特可显著改善子痫前期孕期血清诱导的病理损伤。综上所述，0.3 LSU/mL 舒洛地特可能通过调节sFLT-1/PlGF的分泌平衡改善子痫前期胎盘病理微环境。

目前虽舒洛地特在妊娠高血压疾病防治方面的应用报道较少，但本研究为其可能应用于临床提供了理论和数据支持，特别是低浓度(0.3 LSU/mL)的舒洛地特有望作为妊娠高血压疾病防治的新选择。但由于妊娠高血压疾病患者血清样本例数限制及患者的个体化差异，舒洛地特在改善妊娠高血压疾病方面的应用尚需进一步研究，其在应用过程中的安全性也需要更多实验数据的支持。