覆膜垄播及轮作蚕豆对马铃薯连作田根系分泌物及化感效应的影响

康益晨，杨昕宇，张俊莲，姚彦红，张卫娜，石铭福，范艳玲，要 凯，赵章平，秦舒浩

(1.甘肃农业大学 园艺学院/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州 730070；2.定西市农业科学研究院/甘肃省马铃薯工程技术研究中心，甘肃定西 743000)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)作为世界最重要的非谷物类粮食作物，是全球粮食安全的核心[1]。因其产量高、耐贫瘠的特点，在中国黄土高原西部半干旱区广泛种植[2]。由于低温、干旱等因素限制，加之政府主导下规模种植产生的影响及耕地面积的制约，该区马铃薯连作种植现象极为普遍，连作年限的延长致使连作障碍发生，对作物及土壤危害极大[3-4]。植物的化感作用是引起连作障碍的主要原因[5]，化感作用受水分、温度、营养等环境因素的影响，生长条件越差，植物对化感效应越敏感[6]。马铃薯在生产上极忌连作，连作通常对马铃薯的生长发育产生极大影响，导致马铃薯产量及品质的大幅降低[7-8]。

合理轮作能有效防止连作障碍的发生，是充分用地与积极养地相结合、维系并改良土壤性状的生物学技术手段[9]，在调节土壤养分积累[10]、优化土壤微生物环境[11]、提高作物产量品质[12]等方面都具有积极作用。黄土高原西部半干旱区属雨养农业区，土壤有机质含量低、盐渍化程度高、水土流失严重，实施合理的轮作制度对改善土壤环境、提高作物生产力意义重大[13-14]。豆科植物根系可直接固氮且其残体会在土壤中大量积累，进而增加土壤有机质含量[15-16]，引入豆科植物利于作物耕作系统土壤理化特性的改善，以达到土壤生物修复的目的[17-18]。地膜覆盖技术已被广泛应用于农业生产，尤其在中国干旱和半干旱区作物栽培上取得了显著成效[11]。覆膜垄播耕作方式对作物根际微生态环境及土壤水热生态效应均有改性作用，对土壤生物学特性的影响明显不同于露地栽培，同时给作物根系的生长发育提供了有利条件，对根系分泌物的产生具有很大影响[7-8]。

目前，关于马铃薯—豆科植物轮作的研究主要集中在马铃薯与豆科植物的生长特征、产量、土壤理化性状及微生物群落多样性等方面[8,11]，马铃薯根系分泌物及化感效应等方面的研究主要侧重于露地栽培的连作马铃薯上[19]，且多为单一的根系分泌物鉴定[8]或化感效应生物测试[20]；而关于马铃薯—豆科植物轮作对根系分泌物及其化感作用的影响缺乏深入研究，尤其是对覆膜垄播种植条件下马铃薯—豆科植物轮作系统的研究更是未见报道。因此，研究覆膜垄播及马铃薯—豆科植物轮作对马铃薯连作田根系次生代谢产物及其化感效应的影响迫在眉睫。本研究采用大田定位试验，结合生物测试及实验室精准分析，研究覆膜垄播及轮作蚕豆对马铃薯连作田根系分泌物及化感效应的影响，以期探明连作马铃薯化感及自毒作用发生机理，明确覆膜垄播及轮作蚕豆对马铃薯连作田化感效应的修复机理，为黄土高原西部半干旱区马铃薯连作障碍的克服提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

于2016及2017年4-10月在甘肃省定西市农业科学研究院试验基地(35°33′N，104°35′E)进行，该区为典型的半干旱雨养农业区，海拔1 914 m，日照时数长，年平均气温7.2 ℃，年均降雨量为391 mm。土壤耕层深厚、肥力均匀、蓄水性能良好。试验区土壤基本性质见表1。

表1 试验土壤概况Table 1 General situation of experiment soil

1.2 试验设计

供试材料选取当地马铃薯主栽品种‘青薯9号’及蚕豆品种‘青蚕14号’。 2016年为试区马铃薯连作第5年，以此连作田为基础，栽培方式分为平畦不覆膜(FP)及全膜垄播(RM)，种植制度采用马铃薯—马铃薯连作(C)及马铃薯/蚕豆轮作(R)，共计FP-C、RM-C、FP-R及RM-R 4个处理(图1)，每处理设3个重复，共12个小区，采用随机区组排列，每个小区面积为5.75 m×7.70 m。马铃薯与蚕豆均于4月12日播种，马铃薯每垄种植2株，株距35 cm、行距40 cm；蚕豆每垄种植3株，株距15 cm、行距30 cm；2种作物种植密度分别为53 775株·hm-2与185 070株·hm-2。马铃薯于9月上旬收获，蚕豆于8月中旬收获。肥料采用硝铵磷复合肥料和速溶硫酸钾，施量分别为499.95 kg·hm-2和230.70 kg·hm-2，于播种前一次性基施。次年，施行相同栽培措施并进行指标测定。

图1 试验设计Fig.1 Experimental design

1.3 测定指标及方法

1.3.1 根系分泌物提取 2017年7月中旬(马铃薯盛花期/蚕豆结荚期)，利用5点取样法进行土壤样本采集，抖落马铃薯及蚕豆根系外围土壤，收集根系裹挟的根际土壤。去除土样中的杂物并自然风干后过100目筛。各处理分别取过筛土样6份，每份200 g，置于1 L锥形瓶中，3份加入500 mL甲醇(色谱纯)、另3份加入500 mL蒸馏水。将锥形瓶封口，于恒温振荡器中震荡提取 2 h(频率为160次·min-1)后取出静置1 d。次日，超声波浸提1 h后抽滤。将水相滤液旋转蒸发至100 mL，得到2 g·mL-1的浸提液(1 mL水溶液中含2 g土壤提取物)后将3份分别稀释至0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1和0.4 g·mL-1用作生物测试；甲醇相滤液浓缩至2 mL，经0.22 μm滤膜过滤后的浸提液装入试样瓶中于-80 ℃冻存，用作GC-MS分析。

1.3.2 根系分泌物分析 利用Agilent 7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪(色谱柱：HP-1 60 m×0.25 μm×0.5 μm)对根际土壤的甲醇浸提液进样分析，色谱及质谱条件参照许丽婷[8]的方法。参考NIST质谱数据库，人工分析并利用检索系统对未知物质的结构和名称进行鉴定。

1.3.3 化感效应生物测试 选取种粒饱满、大小一致的番茄品种‘东方红1号’种子(番茄属高原夏菜，当地生产规模大，常与马铃薯换茬播种；与马铃薯同为茄科作物，受化感物质影响相似)作为生物测试材料，60 ℃温汤浸种15 min、常温浸种6 h。将完成浸种的种子冲洗后均匀播在垫有两层灭菌滤纸的培养皿中，每皿播50粒，分别加入10 mL质量浓度为0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1和0.4 g·mL-1的浸提液，对照加入10 mL蒸馏水，所有处理设3个重复。盖好培养皿后放入人工气候箱内28 ℃黑暗培养，每天补充适量浸提液/蒸馏水，始终保持滤纸为润湿状态。次日起每天记录萌发种子(芽长超过2 mm)的数量直至不再有种子萌发，计算发芽率和发芽指数；最后一天利用游标卡尺测量每个培养皿内萌发种子的种芽全长，取平均值。

以化感效应指数(Allelopathy index, RI)衡量化感作用潜力，计算方法参照Williamson等[21]。综合化感效应(Comprehensive allelopathy index, SE)[22]取各处理不同质量浓度的土壤浸提液对番茄种子发芽率、发芽指数及种芽全长化感效应指数的算术平均数，相关性分析时取各质量浓度下SE绝对值的算术平均数。

发芽率=萌发种子数/供试种子数×100%；

发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中Gt为第t天的萌发种子数，Dt的值为对应的时间t；

化感效应指数(RI)=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1(T0表示促进作用，RI<0为抑制作用，其绝对值代表化感效应强度的大小。

1.4 数据处理与分析

分别采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0进行原始数据统计和分析，采用Adobe Illustrator CC 2018、Krona、OmicShare Tools及Origin Pro 2018作图；差异显著性分析利用LSD法(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 各处理根系分泌物种类及相对含量比较

根据GC-MS分析结果，大致可将根际土壤中的提取物主要成分分为：酯类(Ester)、羧酸(Carboxylic acid)、酰胺(Acylamide)、胺类(Amines)、烃类(Hydrocarbon)、醇类(Alcohol)、酚类(Phenol)、醚类(Ether)、醛类(Aldehyde)、酮类(Ketone)、呋喃(Furan)、嘌呤(Purine)、嘧啶(Pyrimidine)、噻唑(Thiazole)、卤代烃(Halohydrocarbon)、硅氧烷(Polydimethylsiloxane)及硅烷(Silane)17类，后3类非根系分泌，为试验方法所致或土壤固有成分，不作比较。

FP-C鉴定出酯类36种，烃类18种，醇类16种，酮类10种，醛类7种，酰胺6种，酚类5种，羧酸及胺类各3种，醚类2种，呋喃、嘌呤及噻唑各1种，另外还鉴定出香兰素(Vanillin)、鲁米诺(Luminol)及樟脑(Camphor)等成分；以酯类、醇类及胺类的相对含量较大，分别为43%、18%及11%，其他类别均不足10%。RM-C鉴定出酯类13种，烃类10种，醇类9种，酮类3种，醛类6种，酰胺2种，酚类4种，醚类2种；酯类及醇类的相对含量最大，分别为56%及9%。FP-R酯类36种，烃类31种，醇类14种，酮类11种，醛类10种，酰胺6种，羧酸5种，酚类及胺类各4种，醚类2种，呋喃、嘌呤、嘧啶及噻唑各1种，从中还鉴定出香兰素；酯类、烃类、醇类及胺类的相对含量较大，分别为38%、15%、14%及12%。RM-R烃类18种，酯类14种，醇类9种，醛类6种，酮类4种，羧酸及呋喃各3种，酰胺、酚类、胺类及醚类各1种；酯类、醇类及烃类相对含量较大，分别为46%、19%及10%。即覆膜垄播减少根系分泌物中酯类、烃类、酰胺、酚酸类及醇、胺、醛等成分类别的数量，同时防止嘌呤、噻唑、香兰素、樟脑及鲁米诺的产生；轮作蚕豆增加根系分泌物中烃类、酮类、羧酸及胺类成分的数量，同时降低酯类物质的相对含量(图2)。不同耕作模式及栽培制度下土壤养分状况及理化特性的变化可能是造成根系分泌物种类及相对含量差异的诱因。

图2 土壤提取物的Krona层级饼图Fig.2 Krona pie chart of soil exudates

2.2 覆膜垄播及轮作蚕豆对根系分泌物的影响

所有处理GC-MS鉴定出的成分总计204种，其中FP-R种类最多(141种)，之后依次为FP-C(123种)、RM-R(67种)及RM-C(54种)。各处理共有的成分为31种，仅占总数的15.2%。FP-C所独有的成分为39种， FP-R多达51种；覆膜垄播处理RM-C独有成分仅为6种，RM-R为8种。FP-C与FP-R间共有成分最多(29种)，与RM-C及RM-R间共有成分仅分别为3种和4种。由此可知，覆膜垄播栽培能减少根系分泌物成分的种类，轮作蚕豆则会致使根系分泌物成分种类的增加；平畦不覆膜栽培条件下，即便轮作蚕豆，仍然与连作处理具有较多共有成分(图3)。

根据根系分泌物各类成分的丰度，对各处理进行聚类分析(图4)。RM-C与RM-R聚作一类，FP-C与FP-R的相对距离极小，即RM-C与RM-R具有相对类似的根系分泌物成分，FP-C与FP-R的根系分泌物组成也较为相似。同时，FP-C与RM-C及RM-R的相对距离最大，根系分泌物差异最大。聚类热图的色彩变化用于反应各处理根系分泌物成分相对丰度的变化(由红到绿相对丰度降低)，酯类、酚类、酰胺及香兰素、樟脑等常见化感物质的相对丰度以处理FP-C最大，FP-R次之，RM-C及RM-R最小。覆膜及沟垄作造成的土壤水热与微生物环境变化可能对马铃薯根系次生代谢物分泌具有极大影响。

水平柱状图表示各处理根系分泌物数量；中间矩阵中的单个黑点表示某个处理特有的元素，点和点之间的连线表示不同处理特有的交集；右侧柱状图表示对应的交集元素数量。

2.3 各处理根际土壤浸提液对番茄种子萌发的化感效应

各处理根际土壤浸提液对番茄种子的萌发具有不同影响，统计发芽率的最后一天(第6天)，FP-C与其他处理在萌发种子数量及芽长等方面具有差异(图5)。由表2可知，浸提液质量浓度为0.1 g·mL-1时，相较对照CK，FP-C的综合化感效应表现为显著的促进性，其发芽指数、种芽全长及两者的化感效应指数显著提高；当质量浓度为 0.2 g·mL-1，FP-C浸提液培养具有显著的抑制性化感效应，发芽率、种芽全长、化感效应指数及综合化感效应均显著降低，其他处理各项指标相较CK无显著性差异。当质量浓度达到0.4 g·mL-1，各处理种芽全长及其化感效应指数均显著减小，综合化感效应表现出显著抑制性；FP-C各项指标及其化感效应指数显著低于各质量浓度的所有处理，综合化感效应最强。即各质量浓度下，处理FP-C浸提液培养对种子的综合化感效应均显著强于对照CK和其他处理，且随浸提液质量浓度的增大，FP-C的综合化感效应表现为先促进后抑制，综合化感效应强度随质量浓度增大显著增强。其他处理的综合化感效应随浸提液质量浓度增大由不显著转变为显著的抑制性。覆膜垄播及轮作蚕豆对马铃薯根系分泌物的极大影响造成了根际土壤化感效应的明显差异。

覆膜垄播及轮作蚕豆的双因素互作分析(表2)可知，浸提液质量浓度为0.1 g·mL-1时，覆膜垄播对种芽全长及其化感效应指数、综合化感效应的影响显著，轮作蚕豆对发芽指数及其化感效应以及综合化感效应影响显著，轮作蚕豆及覆膜垄播的交互作用对发芽指数及其化感效应影响显著。质量浓度为0.2 g·mL-1，覆膜垄播对综合化感效应的影响显著，轮作蚕豆对种芽全长及其化感效应指数及综合化感效应影响显著。质量浓度达到0.4 g·mL-1，覆膜垄播对各指标及其化感效应指数及综合化感效应的影响均达到极显著水平；轮作蚕豆及其与覆膜垄播的交互作用对发芽率、发芽指数及两者化感效应指数的影响达显著水平，对种芽全长及其化感效应指数、综合化感效应的影响达极显著水平。即质量浓度为0.1 g·mL-1及0.2 g·mL-1时，覆膜垄播及轮作蚕豆均对综合化感效应具有显著影响，当质量浓度增加到0.4 g·mL-1，两因素及其互作对综合化感效应的影响均达极显著水平。

2.4 根系分泌物成分与综合化感效应的相关性

根系分泌物中化感物质丰度的大小影响着其化感效应的强弱。对根系分泌物中的部分成分与化感效应生物测试得到的综合化感效应进行相关性分析(图6)，酯类物质中邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二甲酯的相对丰度与综合化感效应SE之间呈显著性强正相关，相关性系数分别为0.99及0.97，其他酯类物质的相对丰度与综合化感效应间相关性未达显著水平。酚类物质中2-叔丁基-6-甲基苯酚的相对丰度与综合化感效应SE之间呈显著性强正相关(r=0.97)。酰胺类中烟肼酰胺的相对丰度与综合化感效应SE之间呈显著性强正相关，相关性系数达0.99。此外，樟脑、香兰素、9H-黄嘌呤及鲁米诺的相对丰度与综合化感效应SE之间均呈显著性强正相关，相关性系数分别为0.99、0.99、0.96及0.98。

图4 差异根系分泌物聚类热图Fig.4 Cluster heat map of different root exudates

表2 各处理对番茄种子萌发的化感效应Table 2 Allelopathic effects of different treatments on tomato seed germination

3 讨 论

长期连作会致使马铃薯根系分泌物的成分及其含量发生极大变化，且部分成分具有化感效应[19]。本试验对平畦不覆膜连作马铃薯根系分泌物进行的研究与该结论相似。FP-C浸提液对番茄种子的综合化感效应均显著强于对照CK和其他处理，且随浸提液质量浓度的增大，FP-C的综合化感效应表现为先促进后抑制，综合化感效应强度随浓度增大显著增强，国外学者[23]认为化感物质具有浓度效应，表现为低质量浓度促进及质量浓度达到“阈值”后渐增的抑制作用，与本研究观点一致。

实施轮作制度可降低自毒物质含量、有效改善土壤环境[24]。本研究表明轮作蚕豆可降低典型化感物质类别酯类的相对含量，同时会致使根系分泌物成分种类如烃类、酮类、羧酸及胺类等成分数量的增加。谭雪莲等[25]近期的研究认为轮作大豆可减少马铃薯连作田根系分泌物的种类，与本研究结果相悖，究其原因可能是试区连作年限及轮作植物种类的差异所致；另有研究表明[26]，不同植物根系分泌物的组成差异较大，轮作制度的实施引入新的作物，因而轮作蚕豆导致根系分泌物成分种类增加的结论具有理论依据。覆膜垄播可提高土壤增温保墒能力、改善土壤质量，对根系次生代谢物的产生有极大影响[27]。本研究表明覆膜垄播栽培不仅能减少根系分泌物成分的种类，而且减少根系分泌物中酯类、烃类、酰胺、酚酸类及醇、胺、醛等成分类别的数量，同时能有效防止嘌呤、噻唑、樟脑、香兰素及鲁米诺的产生，与不覆膜相比成分差异较大。许丽婷[8]认为覆膜垄播种植模式可改变马铃薯连作田根系分泌物的种类，并降低化感物质的相对含量，与本研究结果类似。在此基础上的生物测试表明，轮作蚕豆及覆膜垄播均能显著降低土壤浸提液对番茄种子的综合化感效应，且随浸提液质量浓度增大，两因素互作对综合化感效应的影响达极显著水平。即2种方式对马铃薯连作田根系分泌物有不同的影响，但均可达到降低化感效应的作用，两者结合更有利于马铃薯连作障碍的克服。栽培耕作制度的改善优化了土壤微生物环境[11]，同时利于土壤水分保持及养分积累[10]可能是轮作蚕豆及覆膜垄播对连作马铃薯田土壤化感效应起到缓解的 原因。

“*”和“**”分别表示在P<0.05 和P<0.01 水平下显著相关。

邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、2-叔丁基-6-甲基苯酚、烟肼酰胺、樟脑、香兰素、9H-黄嘌呤及鲁米诺8种物质疑似为马铃薯连作田根际土壤化感成分。其中，邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二甲酯虽被认为是常见的增塑剂[28]，但并未有学者指出其不可被植物根系所分泌，且诸多学者已通过浓度试验证明其为马铃薯的化感自毒物质[19,29]，同时根据本研究的结果，二者含量在连作不覆膜处理中达到最大，覆膜栽培处理中反而相对较小，因而虽有争议，仍需重点关注。2-叔丁基-6-甲基苯酚为酚酸类物质，此类物质广泛存在于植物组织中，与其生长密切相关，被普遍认为具有化感作用[30]；烟肼酰胺属酰胺类物质，该类物质已在多种植物中被鉴定出具有化感效应[31]，因其能在植物体内合成细胞分裂及生长抑制剂，故在生产上常作除草剂使用[32]；9H-黄嘌呤属嘌呤类物质，早在上世纪末，该类物质便被归为化感物质范畴[33]；另外，樟脑对牧草[34]及香兰素对地黄[35]的化感作用也已相继被证明；鲁米诺为酰肼类物质，其与植物化感相关的研究尚未见报道。本研究虽证明上述物质的相对丰度与化感效应具有强相关性，且其中多数已在其他植物上被鉴定为化感物质，但其在马铃薯上的化感自毒作用仍有待后续的研究与验证。

4 结 论

长期连作的露地栽培会导致马铃薯根系分泌物中，酯类、酚类及酰胺等常见化感物质类别的相对丰度增大、化感效应显著增强。轮作蚕豆及覆膜垄播对马铃薯连作田根系分泌物的影响有所不同，其中，轮作蚕豆可降低典型化感物质类别酯类的相对含量，同时增加根系分泌物成分种类；覆膜垄播能减少根系分泌物中酯类、烃类、酰胺、酚酸类及醇、胺、醛等成分类别的数量，并防止嘌呤、噻唑、香兰素及樟脑的产生；两种方式均对马铃薯连作田的化感效应具有改善作用，但两者结合更有利于马铃薯连作障碍的克服。邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二甲酯、2-叔丁基-6-甲基苯酚、烟肼酰胺、樟脑、香兰素、9H-黄嘌呤及鲁米诺8种物质疑似为马铃薯连作田化感物质，其具体影响规律有待进一步研究。