‘雷司令’与‘小芒森’成熟过程中果实理化特性与酚类物质积累间的关联分析

任瑞华，李俊楠，杨 君，宁鹏飞，张振文,3

(1.西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；2.山西尧京酒业有限公司，山西临汾 041500；3.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西杨凌 712100)

酚类化合物是指分子结构中有一个至多个羟基连接在苯环上的植物成分总称，其因能够影响葡萄酒的收敛性、苦味、澄清度和稳定性[1-2]，以及其抗氧化、抗菌、抗病毒[3]和抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化变性[4]等生理作用，得到研究者的重视。依其化学结构，可分为非类黄酮类和黄酮类物质。前者主要是酚酸，包括羟基苯甲酸和羟基肉桂酸及其衍生物等，含量仅占酚类物质的 1%～5%[5-6]。后者包括花色苷类、黄酮醇类、黄烷醇类等。白葡萄中，由于VvmybA1在驯化过程中发生等位基因变异，从而导致花色苷类物质缺失[7]。黄烷醇类则在葡萄及葡萄酒的苦味和收敛性上发挥着重要作用。研究表明，白葡萄中黄烷三醇的含量较低，因而更适合酿造果香丰富的酒[8-9]。自然界中酚类物质通常以糖苷结合态的形式存在，如杨梅酮-葡萄糖苷和槲皮素-葡萄糖苷等[10]。研究报道，糖苷结合态的酚类物质在葡萄浸渍过程中水解释放出游离的糖苷配基，能够增加‘雷司令’和‘霞多丽’葡萄酒花果香味，但未改变其苦味和收敛性[11]。

葡萄酒中的酚类物质主要来源于浸渍和发酵的葡萄。目前研究上多通过各种栽培措施来提高果实酚类物质含量，以提高葡萄酒的品质。如控制叶幕层厚度和摘除副梢[12]、降低葡萄树体负载量[13]及转色期进行适当果粒疏除[14]等，能够显著提高成熟果实酚类物质含量。此外，对果实进行外源糖处理及体外糖饲养葡萄细胞悬浮液也显示上调花色苷相关基因的表达[15-16]。Lecourieux等[17]对蔗糖处理的‘赤霞珠’葡萄进行转录组分析发现，蔗糖处理改变了果实内的信号转导和次生代谢等生物过程，主要影响bzip和bHLH转录因子家族成员对其靶基因的调控。然而，有关果实本身的基本理化特性与酚类物质积累的探讨较少，在白色酿酒葡萄上更鲜有报道。本研究以山西省襄汾地区2种白色酿酒葡萄‘雷司令’和‘小芒森’为试材，探讨不同品种理化特性对果实酚类物质积累的影响，以期为酿酒葡萄品种的选择、提高果实中酚类物质含量和白葡萄酒陈酿潜力提供理论基础。

1 材料与方法

试验于2018-2019年在山西省襄汾县尧京酒庄进行。

1.1 试验材料

供试品种为‘雷司令’(Riesling，RI)和‘小芒森’(Petit Manseng，PM)，2012年定植于山西省襄汾县尧京酒庄(位于山西省中南部，北纬 35～36°，海拔500～600 m，基本处于平原地区。属于半干旱、半湿润季风气候区，暖热多雨，雨热同季，年均气温11.5 ℃，1月平均气温-4.5 ℃，年降雨量550 mm左右，无霜期185 d)。葡萄园南北行向，葡萄树龄7 a，株行距1 m×3 m，单篱架为“厂”字型树形，垂直篱壁式叶幕，单芽修剪，每棵树留8 个梢，常规化管理。

1.2 试验方法

果实采样：花后30 d 9：00-12：00进行第1次采样，花后60 d(转色期)第2次，以后每隔10 d采样1次，直至果实成熟。从果穗的东、西、南、北4个方向及上、中、下部位各采大小一致、无病虫害的样果共600粒，迅速用液氮冷冻，并立即带回实验室，放于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.1 果实还原糖、可滴定酸、可溶性固形物(TSS)、pH和物理指标测定 从每个样品中随机选取50粒浆果，用数显游标卡尺测定浆果横、纵径。剥皮后果肉挤汁用于测定还原糖、可滴定酸、可溶性固形物(TSS)、pH，方法参照《葡萄酒分析检验》[18]。还原糖采用斐林试剂热滴定法，结果以葡萄糖(g/L)计；总酸采用NaOH滴定法，结果以酒石酸计(g/L)；可溶性固形物用手持糖量计；pH使用pH计，均重复3次。

从每个样品中随机选取100粒浆果，称量鲜质量，随后剥皮称量获得百粒浆果果皮鲜质量。将称量后的果实和果肉分别放于干净的培养皿中于72 ℃烘箱中烘至恒质量，称量后计算各自的干质量，重复3次。

1.2.2 浆果果皮总酚和总单宁的提取和测定 提取方法：随机选取-80 ℃冰箱中的冻样10 粒，立即剥皮，将果皮用液氮速冻后打成粉末，在冻干机中冻干。称取1.000 g干粉溶解于10 mL盐酸甲醇溶液(φ=60%甲醇，φ=0.1%盐酸)中， 30 ℃下超声提取30 min，随后4 ℃、10 000 r/min下离心10 min，收集上清液。将沉淀物重复上述提取步骤2次，收集并混合3次提取液放置 -80 ℃储存，重复3次。总酚测定采用福林-肖卡法[19]，总单宁测定采用甲基纤维素沉淀法(MCP法)[20]。

1.2.3 浆果果皮单体酚的提取和测定 单体酚提取：称取‘1.2.2’中的葡萄皮干粉冻样1.000 g，溶于1 mL蒸馏水和9 mL乙酸乙酯的混合液中，25 ℃、130 r/min摇床上震荡30 min(避光)， 8 000 r/min下离心5 min，取上清液于50 mL离心管中，重复上述步骤对沉淀物重复提取4 次，合并混匀所有上清液，33 ℃旋转蒸发至干，最后用色谱甲醇定容至1 mL，-80 ℃下保存，备用，重复3次。单体酚测定采用HPLC-MS/MS法[21]。

1.3 数据处理与统计分析

采用Excel 2010对所有数据进行统计分析，采用SPSS 20.0对数据进行方差分析和独立样本t检验，并用SPSS 20.0对果实理化指标与总酚、总单宁和单体酚含量进行相关性分析。用Excel 2003绘图。

2 结果与分析

2.1 开花、转色和采收时间

由表1可知，2个品种的开花时间接近，均在5月中旬，而‘小芒森’(PM)的转色和采收时间分别较‘雷司令’(RI)晚1周和1个月左右。相比于2018年和2019年2个品种的转色时期较晚(转色时间以50 %的浆果变软为标准)。

表1 2018和2019年开花、转色和果实采收日期Table 1 Flowering,veraison (50% of soft berries) and harvest date in 2018 and 2019

2.2 不同品种浆果生长过程中还原糖和总酸的变化

图1和图2结果显示，2018和2019年2个品种果实还原糖和可溶性固形物含量均随果实成熟而逐渐升高。‘雷司令’果实2 a采收时还原糖均为170 g/L，而‘小芒森’分别高达268和273 g/L，分别是‘雷司令’的1.58倍和1.61倍。由图1和图2还可看出，2018年中花后30～70 d时，2个品种还原糖含量相当，但此后至果实采收时，‘小芒森’均远高于‘雷司令’；而2019 年从花后60 d开始出现差异，到花后90 d时达到最大。 2 a的可溶性固形物含量与还原糖趋势一致，但2019 年较2018有所提高(图1和图2)。可滴定酸含量在2 a间均呈降低的趋势，而2019年含量较2018有所降低。在采收时‘小芒森’可滴定酸含量分别为5.7和5.35 g/L，‘雷司令’分别为 5.45和5.12 g/L。pH的变化与可滴定酸相反(图1和图2)。

图1 2018年不同品种果实生长过程中还原糖和可滴定酸含量的动态变化Fig.1 Dynamic change of reducing sugar and titratable acid content of different berries during grape development in 2018

2.3 不同品种浆果生长过程中果粒大小、浆果和果皮质量的变化

由表2可以看出，2018年‘雷司令’浆果大小(横径×纵径)和横径随果实生长逐渐变大，虽然纵径在花后90～100 d时有所减小，但均在采收时达到最大值；‘小芒森’浆果大小和横纵径在花后70～90 d时不断增大，而此后开始减小。整个生长过程中‘小芒森’果粒显著小于‘雷司令’，但两者的横径/纵径差异较小。2 a中果实大小变化趋势基本一致，但2019年较2018 年果粒有所缩小(表3)。

如图3所示，2018 年‘小芒森’百粒浆果鲜质量和干质量在花后30～90 d期间逐渐增加，而此后有所降低，这与其浆果大小的结果一致；‘雷司令’在整个生长过程中均呈递增趋势，其鲜质量和干质量在采收时分别达到最大值(205.49和 162.83 g)，是同时期‘小芒森’的1.76倍和2.02倍。然而，‘雷司令’百粒浆果果皮鲜质量在花后70～80 d时增加，而此后逐渐降低，果皮干质量则在花后70～100 d时逐渐降低，采收时略有升高；‘小芒森’的果皮鲜质量和干质量在花后30～110 d时表现出一致的递增趋势，而此后略有降低，其在花后90～110 d时显著高于‘雷司令’(图3)。最终，‘雷司令’果皮鲜质量和干质量百分比在果实生长过程中呈总体递减趋势，而‘小芒森’呈递增趋势，平均分别高出‘雷司令’0.89倍和 1.10倍(图3)。2019 年果实和果皮鲜质量及干质量变化趋势与2018年基本一致，但2个品种的果皮鲜质量和干质量百分比均呈递增的趋势，其百分含量也较2018 年有所升高。品种间‘小芒森’仍大于‘雷司令’(图4)。

图2 2019年不同品种果实生长过程中还原糖和总酸含量的动态变化Fig.2 Dynamic change of reducing sugar and titratable acid content of different berries during grape development in 2019

表2 2018年果实成熟期间浆果大小的动态变化Table 2 Dynamic change of berry size during ripening period in 2018

表3 2019年果实成熟期间浆果大小的动态变化Table 3 Dynamic change of berry size during ripening periodin 2019

图上不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同

图4 2019年不同品种果实成熟期间浆果和果皮质量以及果皮占比的动态变化Fig.4 Dynamic change of berry and skin mass and ratio of skin to berry during ripening period in 2019

2.4 不同品种浆果成熟期间总酚和总单宁含量的变化

由图5可以看出，2018和2019 年2个品种果皮总酚含量均随果实成熟而降低。‘雷司令’果皮总酚在花后90～110 d时保持稳定，而‘小芒森’则在花后100～140 d时变化较小。2018 年采收时‘雷司令’和‘小芒森’总酚含量分别为 12.11和19.47 mg/g，2019年有所降低，分别为 11.03和17.06 mg/g。除2018 年花后30 d时外，‘小芒森’均显著高于‘雷司令’，这与还原糖含量和果皮质量的结果一致。

由图6可以看出，2018和2019 年2个品种果皮总单宁含量均随果实成熟而降低。‘雷司令’果皮中的总单宁含量在花后90～110 d时保持稳定，而‘小芒森’在花后110～140 d时变化较小，这与总酚结果基本一致。2018 年采收时‘雷司令’和‘小芒森’的总单宁含量分别为4.14和 12.97 mg/g，类似地，2019 年分别为4.39和 12.68 mg/g。此外，除花后30 d外，‘小芒森’均显著高于‘雷司令’，这与总酚含量的结果一致。

图5 2018和2019年不同品种果实成熟期间果皮总酚含量的动态变化Fig.5 Dynamic change of total phenol content in different cultivars skins during ripening period in 2018 and 2019

图6 2018和2019年不同品种果实成熟期间果皮总单宁含量的动态变化Fig.6 Dynamic change of total tannin content in different cultivars skins during ripening in 2018 and 2019

2.5 不同品种成熟浆果单体酚组分及含量的变化

本研究对2018年2个品种成熟果实的单体酚类物质进行检测，结果显示‘雷司令’中共检测到21种，而‘小芒森’为24种(表4)。其中，有14种在两者中同时出现，7种仅出现在‘雷司令’中，而10种仅出现在‘小芒森’中。这些物质可分为酚酸类、黄烷醇类和黄酮醇三大类，但每类单体物质组分和含量在品种间不同。‘雷司令’中共检测到4种酚酸类物质，其中阿魏酸占比可达 67.68%；‘小芒森’中共检测到9种，没食子酸是其主要成分(58.40%)。‘雷司令’和‘小芒森’中分别检测到4和5种黄烷醇类物质，表儿茶素是主要成分，2个品种分别占黄烷醇总量的78.22%和43.29%。黄酮醇类在3类物质中种类最丰富，在‘雷司令’和‘小芒森’中分别检测到13和10种。杨梅酮、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐在‘雷司令’中含量较高，占黄酮醇总量的75.04%。然而，‘小芒森’中槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-半乳糖苷含量较高。此外，从表4也可以看出2个品种中均出现许多糖基化单体，‘雷司令’和‘小芒森’中分别检测到10和7 种，其糖基化配体主要是葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。

由表4可知，黄酮醇类是2个品种的主要单体酚，分别占总量的98.43%和98.00%(图7)。‘小芒森’中黄酮醇类和酚酸类物质总量均显著高于‘雷司令’，甚至酚酸类物质比‘雷司令’高2.79倍，然而后者的黄烷醇类物质总量显著高于‘小芒森’(图7)。最终，‘小芒森’成熟浆果果皮的单体酚总量比‘雷司令’高6.20%。此外，两者的糖基化类单体酚含量也有所不同。‘雷司令’中糖基化酚类的比例为63.77%，而‘小芒森’高达 97.81%，这与成熟果实还原糖含量的结果一致。

表4 2018年不同品种成熟果实单体酚组分及含量Table 4 Monomer phenol components and contents in ripe fruits of different varieties in 2018

图7 2018年不同品种成熟浆果果皮单体酚组分及比例Fig.7 Composition and percentage of monomer phenol in ripe berries-skins of different cultrivars in 2018

2.6 果实基本特性与酚类物质的相关性分析

为了探讨果实理化特征与酚类物质积累的关系，本研究对2个品种果实的基本指标与果皮中总酚、总单宁和单体酚含量进行相关性分析，结果显示果皮的总酚、总单宁和单体酚含量均与浆果鲜质量和干质量负相关，且浆果干质量与总单宁含量在0.05水平上有显著性差异(表5)。然而，其他指标与酚类物质含量正相关。果皮干质量百分比与总酚和总单宁的相关系数最高，还原糖、总酸、浆果鲜质量和干质量百分比与单体酚含量相关性较高。

表5 果实特征与酚类物质的相关性分析Table 5 Correlation analysis between fruit characteristics and phenol content

3 讨论与结论

尽管葡萄果实的酚类物质组成和含量受生长条件、气候、土壤、品种和果实成熟度等多种因素影响[22]，但品种的基因型对其影响超越任何环境因素[8]。Somkuwar等[23]对9个白色酿酒葡萄果实酚类物质研究显示，不同品种的酚类物质含量差异较大，其中‘大满胜’含量最高，‘长相思’次之，‘雷司令’中等，而‘鸽笼白’和‘白诗南’含量最低。杨涛等[24]对新疆地区几个白色酿酒葡萄的酚类物质分析表明，’小芒森’果实酚类物质含量较高。类似的，本研究中也发现‘小芒森’的总酚、总单宁和单体酚含量在整个成熟过程中均显著高于‘雷司令’。品种能够决定葡萄的果粒大小、质量、果皮比例和果实糖酸含量等特征，而这些也是影响果实品质的重要因素。乐小凤等[25]对香格里拉和宁夏玉泉营地区不同粒径大小的‘霞多丽’酚类物质进行研究，结果表明总酚含量为小果粒>中果粒>大果粒。果粒大小能够影响浆果的比表面积(浆果表面积∶浆果体积)，相较于大果粒而言，小粒果实具有更大的果皮比表面积，因而能够积累更多的酚类物质，最终能够提高葡萄酒中酚类物质[26-28]。这与本研究中‘小芒森’果实较小的果粒，较高的果皮比重，以及成熟果实中较高的酚类物质含量一致。此外，糖作为次生代谢的前体物，也能影响果实酚类物质形成。Hosu等[19]对罗马尼亚地区3个白色酿酒葡萄的酚类物质积累研究显示，果实酚类物质与糖含量具有较高的相关性。Castellarin等[29]和Martínez-Lüscher等[30]报道，在果实生长发育过程中，花色苷的合成与果实糖含量增长同步，且可溶性固形物(TSS)与果实花色苷含量呈显著正相关。本试验相关性分析结果也表明：酚类物质含量与还原糖、果皮质量及其果皮百分比呈正相关。依此，‘小芒森’果实中高的酚类物质含量可能得益于其较小的果粒、较高的果皮比重和还原糖含量。

相异于红色品种，白葡萄果实单体酚类主要由酚酸、黄烷三醇和黄酮醇三大类组成，可以提供葡萄酒所需要的酒体，其含量也有助于酿酒师决定葡萄是适宜直接食用还是进一步酿酒[31]。本研究结果显示，酚酸和黄烷三醇在2个品种中占比均较低，这可能与白葡萄酒较弱的苦味和收敛性有关[8-9]。然而，黄酮醇类物质则是2个品种中主要的单体酚，在两者中占比均高达90%以上，这与杨涛等[24]和Brandt等[32]的研究结果一致。黄酮醇类物质呈黄色，有助于白葡萄酒颜色的展现，因为其能够抵抗UV和病原菌入侵植物，并为葡萄酒提供抗氧化属性而受到广大研究者的关注[33-34]。研究报道，黄酮醇类物质的组成和含量在品种间存在显著差异，可作为品种间识别的标志[28,33,35]。本研究中‘小芒森’果皮黄酮醇含量略高于‘雷司令’，但后者种类更丰富。‘雷司令’中杨梅酮、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐占黄酮醇含量较高，而槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸酐、山奈酚-3-O-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-半乳糖苷在‘小芒森’果实中含量较高，这与杨涛等[24]的研究结果一致。然而，Brandt等[32]和Samoticha等[36]的研究表明在‘雷司令’果实中未检测到杨梅酮，这与本研究结果相异。可能是因为单体酚类物质的高效液相色谱检测受色谱条件、分析标品及检测方法等多种因素影响。因此，为了明确‘雷司令’果实的标志性物质，还需要进一步优化试验条件和再次检测。

此外，本研究中2个品种均存在较高比例的糖基化黄酮醇类物质，这可能与糖作为糖基配体参与果实次生代谢产物的糖基化修饰相关[19]。糖基化是赋予和调节细胞中小分子物质活性的关键机制[37]，能够赋予黄酮醇类物质生物医学活性，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷能够诱导胆固醇的合成因而具有保护细胞的活性、槲皮素葡萄糖苷酸具有抗动脉粥样硬化的活性、槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸和槲皮素-3-O-半乳糖苷具有抗抑郁的活性[33,38]。通过糖基化也能够提高黄酮醇类物质的水溶性和稳定性，使其易于积累在细胞中[39]。果实中存在许多糖基转移酶[28,40]，如Fh3GT1利用UDP-葡萄糖提供的糖供体参与矮牵牛中类黄酮物质的糖苷化[41]。这些糖基化物质的出现也增加了次生代谢产物的多样性，如黄酮醇-3-O-葡萄糖苷酸、黄酮醇-3-O-葡萄糖苷和黄酮醇-3-O-半乳糖苷[39]。本研究中，‘小芒森’果皮中糖基化占比为97.81%，显著高于‘雷司令’，这可能与糖苷结合态物在转色后积累有关[42]，果实中较高的还原糖为糖基化反应提供基础。

综上所述，与‘雷司令’相比，’小芒森’果实较小的果粒、较高的果皮占比和还原糖含量有利于酚类物质积累，使其含量最终高于‘雷司令’。这将为产区进行酿酒葡萄品种的选择提供依据及未来果实酚类物质积累的研究奠定基础。