生防细菌复配对苹果主要病原真菌抑菌活性筛选及其稳定性

李恩琛，张文军，张树武，徐秉良，刘 佳

(甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070)

苹果是世界上栽培面积最广的的水果之一，其富含维生素及人体必须的微量元素[1]。目前，中国是世界苹果生产大国，无论是栽植面积，还是年均产量均居世界第一[2]。然而，苹果病害已经严重影响苹果产量和质量，制约着苹果产业的发展。当前，苹果病害的防治仍以化学农药为主，但是其大量或不合理使用，不但对人畜及环境造成严重危害，而且能够导致病原菌产生抗药性[3-5]。微生物防治苹果病害具有诸多优点，如对环境安全、对有益微生物无影响、对人畜健康有利、兼防兼治、促生等，是一种无公害植保新技术，目前对于微生物防治苹果病害的研究较多，如邓振山等[6]分离出的4株苹果树内生真菌均对苹果树腐烂病菌有较强的抑制作用；马志峰等[7]研究表明EM活性菌泥对苹果树腐烂病防治效果好，能有效促进病疤的愈合；王洋娟[8]研究指出，多年施用微生物菌肥能明显改善苹果花脸和腐烂病发病情况。

近年来，生防细菌由于其繁殖速度快，不污染环境，对人畜健康安全，其分泌的拮抗物质不仅对病原菌有较强的抑制作用，而且容易生产，成本低，所以生防细菌在农业生产中具有广泛的应用前景，尤其在苹果病害防治中已成为目前研究的热点之一[9-13]。然而，相关学者研究表明，单一生防细菌菌剂在实际生产中存在对环境适应能力弱，效果不显著和稳定性差等弊端，但是不同生防菌株间混配使用可以优势互补，增强生物防治效果，提高稳定性[14]。陈志谊等[15]研究表明拮抗细菌间的混合使用可以有效提高对植物病害的防治效果；葛红莲等[16]研究发现复合细菌菌剂PB12不仅能够有效防治黄瓜疫病，而且能够促进黄瓜幼苗生长，改善土壤酶活性。因此，将不同拮抗细菌进行复配可以在一定程度上解决单一生防菌在实际应用中存在的许多问题，更好的防治苹果病害。同时，已有研究表明不同温度、酸碱度和紫外线照射等条件对生防细菌的抑菌活性具有显著的影响，如牛伟等[17]研究发现枯草芽孢杆菌B26粗提物对高温具有一定的耐受性，对pH有比较宽的适应范围，但紫外照射对其抑菌活性有一定影响。然而，目前有关不同温度、酸碱度和紫外线照射等条件对生防细菌抗苹果主要病原菌活性方面研究较少。

本试验以5种苹果主要病原菌为研究对象，测定不同生防细菌及其复配的室内抑菌效果，以及复配生防细菌发酵液在不同环境下对苹果树腐烂病菌的抑制效果及稳定性变化，旨在为后期新型微生物药剂的研制与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试病原菌 苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽叶枯病菌(Glomerellacingulata)、苹果轮纹病菌(Macrophomakawatsukai)、苹果霉心病菌(Alternariaalternata)和苹果斑点落叶病菌(A.mali)均由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室保存。

1.1.2 供试生防细菌 解淀粉芽孢杆菌TS-1203(TS-1203)(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌BS-1208(BS-1208)(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌GS-1209(GS-1209)(B.licheniformis)和多粘类芽孢杆菌FS-1206(FS-1206)(Paenibacilluspolymyxa)均由甘肃农业大学植物保护学院植物病理学实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 生防细菌发酵液制备 单一生防细菌发酵液的制备：在100 mL NB中接种一环在NA上活化了24 h的生防细菌，置于28 ℃、180 r/min的恒温摇床黑暗振荡12 h，获得种子液。在无菌的NYBD(60 mL)培养基中接种5 mL生防细菌种子液，在同样的条件下黑暗振荡48 h后获得该生防细菌发酵液。

复配生防细菌间发酵液的制备：在100 mL NB中接种一环NA上活化了24 h的生防细菌，摇床振荡12 h，获得种子液。在灭菌NYBD(60 mL)中加入不同比例生防细菌混合种子液5 mL(表1)，在同样条件下摇床振荡48 h后，可获得生防细菌发酵液。

表1 不同生防细菌种子液复配比例Table 1 The mixture ratio of different bio-control bacteria seed solution

1.2.2 生防细菌发酵液对苹果主要病原菌的抑菌作用测定 抑菌效果测定参考智小青等[18]采用的纸碟法和魏少鹏等[19]采用的菌丝生长速率法，对纸碟法略作修改。接种苹果病害菌饼(d=5 mm)于平板中央，将分别蘸有单一或复配生防细菌发酵液的圆形纸片(d=6 mm)放于距离中心位置2 cm的“十”字两端，以蘸有无菌水的圆形纸片作为对照，并置于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养5～7 d后，采用十字交叉法测量病原菌菌落直径，每个处理和对照均重复3次，并计算单一和复配生防菌发酵液对苹果病菌的抑菌活性。

抑菌率=(对照病原菌落直径-处理病原菌落直径)/(对照病原菌落直径-5)×100%

1.2.3 温度对复配生防细菌抑菌稳定性影响 依次吸取前面筛选出的最佳复配生防细菌发酵液20 mL置于无菌试管中，经30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃不同温度的水浴锅中处理发酵液60 min和在120 ℃的高温灭菌锅中灭菌30 min，当不同温度处理的发酵液温度恢复至室温时，采用纸碟法和菌丝生长速率法测定抑菌活性。对照为未进行温度处理的复配生防细菌发酵液，每个处理重复3次。

1.2.4 紫外线对复配生防细菌抑菌稳定性影响 吸取筛选出的备用最佳复配生防细菌发酵液20 mL于直径90 mm无菌培养皿中(不加盖)，水平放置于254 nm紫外灯下，垂直距离20 cm，分别照射1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h。采用纸碟法和菌丝生长速率法测定抑菌活性。对照不经紫外线照射，每个处理及对照均重复3次。

1.2.5 pH对复配生防细菌抑菌稳定性影响 吸取筛选出的备用最佳复配生防细菌发酵液 20 mL于无菌试管中，利用1 mol/L HCl或 1 mol/L NaOH溶液分别调整pH为2～12，并置于28 ℃和180 r/min的恒温摇床黑暗振荡 12 h后调回原始发酵液pH(6.3)。采用纸碟法和菌丝生长速率法测定抑菌活性。试验以未经pH处理的复配生防细菌发酵液作为对照，每个处理及对照均重复3次。

1.3 数据处理

试验数据利用 Microsoft Excel 2010整理，并采用SPASS19.0统计分析软件和Duncan氏新复极差法对数据进行方差分析及其差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 单一生防细菌发酵液对苹果主要病原菌的抑制作用

4种单一的生防细菌发酵液对5种苹果病原真菌具有不同的生长抑制作用，且不同生防细菌发酵液间存在明显差异(图1)。BS-1208对苹果炭疽叶枯病菌抑菌效果最好，抑菌率达65.74%(图1-A)；TS-1203对苹果轮纹病菌和霉心病菌抑菌效果最好，抑菌率分别达到64.92%和 65.19%(图1-B)；FS-1206对苹果树腐烂病菌和苹果斑点落叶病菌的抑菌效果最好，抑菌率分别达到 78.19%和72.87%(图1-C)；GS-1209对苹果树腐烂病菌抑制效果最好，为63.14%(图1-D)。因此，4种单一生防细菌对5种苹果病原真菌的抑制作用中，FS-1206对苹果树腐烂病菌的抑制效果最佳。

A.枯草芽孢杆菌BS-1208；B.解淀粉芽孢杆菌TS-1203；C.多粘类芽孢杆菌FS-1206；D.地衣芽孢杆菌GS-1209；1. 苹果炭疽叶枯病菌；2. 苹果轮纹病菌；3. 苹果树腐烂病菌；4.苹果斑点落叶病菌；5.苹果霉心病菌；图上不同小写字母表示经 Duncan氏新复极差法检验在0.05水平差异显著，下同。

2.2 复配生防细菌对苹果主要病原菌的抑制作用

研究结果表明，不同比例的复配生防细菌发酵液对苹果主要病原菌的抑制作用存在明显差异(图2)。在不同比例的复配菌株组合中，除 FS-1206∶TS-1203 = 2∶1对苹果树腐烂病菌和霉心病菌的抑制效果优于单一菌株外，其他各复配组合均无显著增效作用(图2)。当生防细菌复配比例为FS-1206∶BS-1208=2∶1时，其对苹果轮纹病菌抑制效果最好，抑菌率为61.03%，但显著低于单一菌株TS-1203抑菌率64.92%(图2-A和图1-B)；当生防细菌复配FS-1206∶TS-1203 = 2∶1时，对苹果斑点落叶病菌抑制效果最好，抑菌率为71.58%(图2-B和图3)，而单一菌株FS-1206对苹果斑点落叶病菌抑菌率为72.87%(图1-C)；当生防细菌复配为FS-1206∶BS- 1208∶GS-1209 = 2∶1∶1时，对苹果炭疽叶枯病菌抑制效果最好，抑菌率为64.41%，单一菌株BS-1208抑菌率为65.74%(图2-F和图1-A)。FS-1206∶TS-1203 = 2∶1时,对霉心病菌抑菌率(67.99%)相比单一菌株TS-1203(65.19%)有所提高；对苹果树腐烂病菌抑菌率为86.64%，显著高于最优单一菌株FS-1206的抑菌率 78.19%。因此，在所有复配组合中，当生防细菌FS-1206和TS-1203复配且复配比例为2∶1时，对腐烂病菌的抑制效果最好(图3)，与单一菌株相比能显著提高对腐烂病菌的抑菌活性。

A.多粘类芽孢杆菌FS-1206和枯草芽孢杆菌BS-1208；B.多粘类芽孢杆菌FS-1206和解淀粉芽孢杆菌TS-1203；C.多粘类芽孢杆菌FS-1206和地衣芽孢杆菌GS-1209；D.多粘类芽孢杆菌FS-1206、解淀粉芽孢杆菌TS-1203和枯草芽孢杆菌BS-1208；E.多粘类芽孢杆菌FS-1206、解淀粉芽孢杆菌TS-1203和地衣芽孢杆菌GS-1209；F.多粘类芽孢杆菌FS-1206、枯草芽孢杆菌BS-1208和地衣芽孢杆菌GS-1209;1. 苹果炭疽叶枯病菌；2. 苹果轮纹病菌；3. 苹果树腐烂病菌；4.苹果斑点落叶病菌；5.苹果霉心病菌

2.3 温度对复配生防细菌FS-1206与TS-1203抑菌稳定性影响

不同温度处理对复配生防细菌FS-1206与TS-1203的抑菌活性具有不同程度的影响。与对照相比，当处理温度为30～80 ℃时，其对复配生防细菌FS-1206与TS-1203发酵液的抑菌活性无显著影响，但是当处理温度为100 ℃和120 ℃时，其抑菌活性逐渐降低，与对照相比差异显著(图4)。

2.4 紫外线对FS-1206与TS-1203复配后抑菌稳定性影响

不同时间紫外照射处理对复配生防细菌FS-1206与TS-1203的抑菌活性具有不同程度的影响。与对照相比，当紫外照射时间在≤3 h时，其对复配生防细菌FS-1206与TS-1203发酵液的抑菌活性影响较小。当紫外照射时间≥4 h时，其抑菌活性逐渐下降，但抑菌率均大于70%。说明发酵液对紫外光长时间的照射有较好的稳定性(图5)。

A.炭疽叶枯病菌；B.轮纹病菌；C.腐烂病菌；D.斑点落叶病菌；E.霉心病菌；CK.CK-A～CK-E.对照

图4 不同温度下复配生防细菌FS-1206与TS-1203发酵液的抑菌活性Fig.4 Antifungal activity of the fermentation broth compounded with biocontrol bacteria FS-1206 and TS-1203 at different temperatures

2.5 pH对FS-1206与TS-1203复配后抑菌稳定性影响

经不同pH处理的发酵液在pH 6～9时其抑菌活性稳定，在强酸强碱条件下，发酵液对腐烂病菌的抑菌率与对照相比呈显著性差异，但其抑菌率均大于71%，即复配发酵液中的抑菌活性物质对强酸强碱有较好的耐受性(图6)。

3 结论与讨论

本试验结果表明，4种单一生防细菌中多粘类芽孢杆菌FS-1206对苹果树腐烂病菌的抑制效果最好；不同生防细菌间复配，当多粘类芽孢杆菌FS-1206∶解淀粉芽孢杆菌TS-1203=2∶1时，对苹果树腐烂病的抑菌效果最好，其抑菌率要显著优于单个生防细菌多粘类芽孢杆菌FS-1206。翟一军等[20]研究发现复配细菌生物防治效果优异，较单一菌株适应环境能力强，定殖能力好，并能诱导植物产生抗性。本试验中将不同生防细菌混合发酵之后，发现复配生防细菌发酵液对苹果树腐烂病菌的抑菌效果明显优于单一生防细菌，其可能原因是两菌株间协同增效，产生多种拮抗物质共同作用，这与申爱荣等[21]、易龙等[22]、李湘民等[23]和陶晶等[24]学者报道的两种生防细菌复配对马铃薯青枯病、烟草赤星病、水稻纹枯病和番茄立枯病的防治效果优于单一菌株的研究结果一致。

图5 紫外线不同照射时间下FS-1206与TS-1203复配后发酵液的抑菌活性Fig.5 Antifungal activity of fermentation broth after compounding FS-1206 and TS-1203 under different ultraviolet irradiation time

图6 FS-1206与TS-1203复配发酵液在不同pH下的抑菌活性Fig.6 Antifungal activity of FS-1206 and TS-1203 mixed fermentation broth at different pH

相关研究发现，生防细菌产生的活性物质的稳定性易受到周围环境因素的影响，多种防效良好的生防菌株由于其拮抗物质稳定性差而难以进一步利用[25]。岳东霞等[26]发现紫外线对黄瓜内生性细菌枯草芽孢杆菌B10的抑菌活性影响不明显，而温度过高或者酸碱度过大会明显影响其抑菌活性。张慧等[27]研究表明紫外线照射、高温和强酸强碱的处理对枯草芽孢杆菌CS16抑菌活性物质的稳定性影响较小。侯宝宏等[28]表明在紫外线照射、高温和极酸极碱条件对解淀粉芽孢杆菌TS-1203发酵粗提液的稳定性有一定的影响。本试验结果表明，FS-1206与TS-1203复配后发酵液产生的抑菌活性物质稳定性良好，其中紫外线对其抑菌活性影响较小。同时，在高温和强酸强碱条件下，复配发酵液也具有较好的稳定性。综上，FS-1206与TS-1203复配发酵液在苹果树腐烂病防治方面具有良好的应用前景。此外，关于此复配发酵液的田间试验效果有待进一步深入研究。