紫果西番莲皮中多酚组成及其抗氧化活性研究

张玲，吴晓颖，黄启慧，李春海，*，陈淇，钟育南

（1.广东石油化工学院广东省岭南特色果蔬加工及应用工程技术研究中心，广东普通高校食品科学创新团队，广东高校果蔬加工与贮藏工程技术开发中心，广东茂名525000；2.广东石油化工学院生物与食品工程学院，广东茂名525000）

西番莲（Passiflora edulis），西番莲科西番莲属，原产于巴西，能散发出石榴、菠萝等多种水果的综合风味，又称百香果[1]。富含维生素、膳食纤维、碳水化合物等营养成分，多酚物质、黄酮类化合物、生物碱等生物活性成分含量也极其丰富。在我国的两广地区、海南、台湾等地区种植历史悠久[2]。

西番莲果实可用于制作果汁、果酱、果脯等制品，用途广泛[3]。西番莲果皮占整果质量的一半，利用率却不高，造成极大的浪费。果皮中多酚物质含量丰富，具有广阔的研究前景。近年来，大量研究表明多酚物质具有舒缓压力、延缓衰老、预防心脑血管疾病、预防癌症、抗胆碱能等功效[4-6]。

目前，我国对西番莲果皮营养物质的研究多在对果皮中的果胶、膳食纤维、黄酮和多糖等的提取及工艺优化，对多酚物质的提取及抗氧化研究较少。李霞等[7]通过微波辅助法对西番莲果皮多糖进行提取并进行体外抗氧化活性研究。杨丹等[8]采用响应面法对提取果皮中的总黄酮进行了工艺优化。程明明等[9]分析了两种超微粉碎法对果皮中水不溶性膳食纤维的改性研究效果。

本试验主要通过液质联用分析技术对西番莲果皮中多酚物质进行定性分析，评价了多酚粗提物清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，并研究了对花生油的抗氧化效果，为西番莲果皮多酚物质研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茂名本地新鲜紫皮西番莲，色泽鲜艳，无腐烂无病变无霉变。

无水乙醇：上海凌峰化学试剂有限公司；三氯化铁、没食子酸、硫酸亚铁、水杨酸、邻苯三酚（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；香草醛：阿拉丁；福林酚试剂：天津市光复精细化工研究所；过氧化氢（30%，分析纯）：天津市百世化工有限公司。

DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱：上海申光仪器仪表有限公司；SL-1000A型高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金厂；HH-2数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；LGJ-10C型冷冻干燥机：四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司；722N可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；UPLC1290-6540BQ-TOF超高压液相色谱-质谱联用仪：安捷伦公司。

1.2 紫果西番莲皮多酚的提取及得率测定

1.2.1 紫皮西番莲果皮多酚提取及干燥

参考马于然等[10]报道的紫果西番莲皮多酚提取方法。称取一定量的西番莲果皮粉，按照料液比为30mL/g加入体积分数为60%乙醇溶液，在40℃下恒温提取150 min，抽滤后，将提取液进行旋蒸浓缩，最后冷冻干燥制得多酚醇提物。

1.2.2 多酚得率的测定

1.2.2.1 多酚含量的测定

采用福林酚比色法，根据燕雪花等[11]方法略有修改。

称取0.100 g没食子酸，用蒸馏水溶解，配制成0.001 g/mL标准溶液备用。吸取1.00 mL没食子酸标准溶液和福林酚试剂于10 mL显色管中，混合摇匀，于1 min内加入3 mL10%Na2CO3溶液，加水至刻度，暗处放置反应1 h，同时用蒸馏水做参比溶液，在波长700 nm～900 nm范围内扫描确定最大吸收波长。

准确吸取 0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL没食子酸标准溶液，其余操作同上，于最大吸收波长下测定吸光值，以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

准确吸取蒸馏水、样品溶液各1.00 mL于10mL显色管中混合均匀，再加3 mL10%Na2CO3溶液，避光反应1 h后在最大吸收波长下测定吸光值，并根据线性方程计算得出多酚浓度。

1.2.2.2 多酚得率的测定

多酚得率计算公式如下：

式中：H为多酚得率，%；C为标准曲线多酚浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为西番莲果皮样品质量，g。

1.3 多酚粗提取物的定性检验

取0.100 g干燥后的紫果西番莲皮醇提物于试管中，然后加入10 mL蒸馏水，充分溶解，配制成质量浓度为10 mg/mL的溶液。

1.3.1 三氯化铁反应

取3 mL质量浓度为10 mg/mL的多酚溶液于试管中，加入几滴1%三氯化铁溶液，观察并记录现象[12]。

1.3.2 三氯化铁-乙醇反应

取3 mL质量浓度为10mg/mL的多酚溶液于试管中，加入适量2%三氯化铁-乙醇溶液，同时提取液与溴水反应，观察并记录现象[13]。

1.3.3 香草醛-盐酸反应

取3 mL质量浓度为10 mg/mL的多酚溶液于试管中，加入适量香草醛-盐酸溶液，观察并记录现象[13]。

1.4 紫果西番莲皮乙醇提取物多酚成分的液质分析

1.4.1 紫皮西番莲多酚前处理

多酚样品前处理方法参考张玲等[14]略有修改，取样品适量，经0.22 μm滤膜过滤后进样。

1.4.2 液质联用分析条件

高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC） 条件：Agilent1290/maXis impact；Agilent eclipse plus C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；检测器：Agilent-DAD检测器；进样器：G4226A；二元泵：G4220A；柱温：30 ℃；流速：0.200 mL/min；进样量：10 μL流动相：甲醇∶0.100%甲酸水=15∶85（体积比）。

四极杆-飞行时间质谱联用（quadrupole time-offlight mass spectrometry，Q-TOFMS/MS）条件：MS QTOF-G6540B；ESI源：全扫描质谱负离子模式，载器温度350℃；负离子模式荷质比扫描范围：100 m/z～1 000 m/z；毛细管电压：100 V；雾化压力：35.000 psi；干燥气流量10 L/min；干燥气温度：300℃。

1.5 抗氧化活性研究

1.5.1 清除羟基自由基能力

参考袁磊等[15]方法略有修改。取6支试管编号，每支试管同时加入1 mL 3 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 3 mmol/L水杨酸，1号试管加入水作为对照，其它试管分别加入梯度为 0.050 mg/mL的0.050 mg/mL～0.250 mg/mL 多酚样液 1 mL，2 mL 3 mmol/L H2O2，37 ℃水浴30 min。与此同时用10倍浓度的VC溶液进行对照试验，于510 nm处测定吸光值。

式中：A1为空白对照组吸光度；A2为多酚样液吸光度。

1.5.2 清除DPPH自由基能力

参考唐福才等[16]和覃丽等[17]方法略有修改。取6支试管编号，2 号～6 号试管加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多酚样液，加2 mL 0.1 mmoL/L DPPH溶液。1号试管加入2 mL无水乙醇和2 mL DPPH自由基溶液作为空白对照，以无水乙醇为参比，在517 nm处进行吸光值测定。配制质量浓度梯度为2 μg/mL的4 μg/mL～12 μg/mL VC溶液进行对照试验。

式中：Ac为2 mL DPPH溶液+2 mL多酚样液的吸光值；Ai为2 mL多酚样液+2 mL无水乙醇的吸光值；As为2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇的吸光值。

1.5.3 清除超氧阴离子自由基能力

采用邻苯三酚法进行清除超氧阴离子自由基能力测定，参考张志军等[18]和黄健文等[19]方法。取6支试管编号1～6，加入7 mL Tris-HCl缓冲液，25℃水浴10 min。1号试管加入1 mL蒸馏水，2号～6号加入1、2、3、4、5 mg/mL 多酚样液 1 mL，水浴 5 min。在 320 nm处测定吸光值，同时用等浓度VC溶液进行对照试验。

式中：A1为空白对照组吸光度；A2为多酚样液吸光度。

1.6 紫果西番莲皮多酚抗氧化性质的应用研究

1.6.1 油脂的加速氧化试验

脂肪的初级氧化产物是氢过氧化物，多酚等作为抗氧化剂可延缓油脂的抗氧化过程，本试验参考左映平等[20]试验方法略有修改。采用烘箱法进行油脂的加速氧化试验。分别取处理过的花生油和未经处理的花生油30 g于广口瓶中，充分搅拌均匀后置于（60±1）℃的恒温干燥箱中加速氧化过程，每隔12 h搅拌混合均匀并交换位置，每1天取样测定POV值，并计算抑制率。

1.6.2 过氧化值（peroxide value，POV值）的测定和抑制率的计算

根据GB 5009.227-2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》植物油脂POV值测定方法进行测定，以1 kg样品中活性氧的毫摩尔数计算过氧化值。

抗氧化剂对油脂氧化的抑制率按下面公式进行计算：

式中：X为添加抗氧化剂油样的POV值；Y为未添加抗氧化剂油样的POV值。

1.6.3 西番莲果皮多酚的抗氧化作用

准确称取30g花生油3份，按照质量比为0.250%、0.500%、0.750%分别加入干燥的果皮多酚醇提物，搅拌均匀后置于恒温箱中保存，后续操作如1.6.1，分别测定花生油的过氧化值和抑制率。

1.6.4 儿茶素抗氧化作用的阳性对照试验

准确称取30g花生油3份，按照质量比为0.250%、0.500%、0.750%分别加入儿茶素，搅拌均匀后置于恒温箱中保存，后续操作如1.6.1。

2 结果与分析

2.1 多酚粗提物的定性检验

多酚粗提取物的显色定性分析结果见表1，显色试验照片见图1。

表1 西番莲皮多酚粗提取物的定性试验Table 1 Qualitative experiment of passionflower peel polyphenols

综合表1中颜色特征和图1照片结果分析，进一步阐述西番莲皮存在多酚物质，可进行液质联用分析及抗氧化活性研究。

2.2 没食子酸标准曲线的绘制

用质量浓度为0.001 g/mL的没食子酸标准溶液在700 nm～900 nm以10 nm为间隔测吸光度，在760 nm处测得最大吸光度，结果如图2。

图1 西番莲皮多酚粗提物的定性试验结果Fig.1 Qualitative experimental results of passionflower Peel Polyphenols

图2 最大波长扫描图Fig.2 Maximum wavelength scan

在760 nm条件下以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作曲线，得到回归方程为y=12.918x-0.0394，R2=0.992 3的标准曲线，如图3。该曲线表明吸光度在0.2～0.8之间线性良好，对多酚物质具有研究意义。

图3 没食子酸标准曲线Fig.3 Standard curve of gallic acid

2.3 液质联用分析

多酚提取物经过处理后进入HPLC-ESI-MS系统进行分离检测，紫皮西番莲多酚提取物的HPLC-ESIMS总离子流图结果如图4。

图4 多酚提取物的HPLC-ESI-MS总离子流图Fig.4 Total ion flow chart of polyphenol extract by HPLC-ESI-MS

由图4可以看出，化合物的极性大小可能与保留时间有关，有些极性相对较强的化合物在柱上的保留时间较短，分离效果较不理想。但随着时间的增加，色谱峰相邻峰差距明显，分离效果较好。色谱峰高低与总离子流强度、相对分子质量成正比相关关系，总粒子流强度越高，相对分子质量越大，色谱峰值越大。

结合孙慧等[21]和Soong等[22]研究进行定性分析，根据主要色谱峰的保留时间、主要质谱碎片峰、相对质量大小和极性大小初步推测西番莲果皮多酚分子式和种类，并结合标准品进行鉴定，结果见表2。

表2 多酚提取物的HPLC-ESI-MS定性分析结果Table 2 Qualitative analysis of polyphenol extracts by HPLC-ESI-MS

在甲醇-甲酸-水流动相中，共分离得到14种物质，鉴别出13种物质，另有一种无法鉴别。在这13种物质中，有4种属于黄酮醇类，分别为槲皮素、表没食子儿茶素、芦丁和山奈酚，有2种属于异黄酮类，分别为白藜芦醇和虎杖苷，有2种属于酚酸类，分别为没食子酸和表儿茶素，有2种属于黄酮苷类，分别为异荭草苷和荭草苷，有3种属于黄酮类，分别为木犀草素、牡荆素和异牡荆素。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 清除羟基自由基能力

羟基自由基是活性氧自由基，半衰期极短，水杨酸环境下能迅速与提取物产生颜色反应，颜色深浅与吸光度大小呈反比关系[23]。以样液和VC的质量浓度为横坐标，羟基自由基的清除率为纵坐标作双X双Y图，如图5。

结果表明，在该体系下，当羟基自由基清除率同为30%时，VC的质量浓度（2.5 mg/mL）约为西番莲果皮多酚质量浓度（0.25 mg/mL）的10倍，果皮多酚清除羟基自由基的能力远强于VC。从质量浓度-自由基清除率方程来看，二者质量浓度与自由基清除率之间有良好的线性相关性，从斜率可知，随着质量浓度的增大，果皮多酚对羟基自由基的清除率增速远大于VC。从IC50值来看，果皮多酚的IC50值为0.328 mg/mL，VC溶液的IC50值为3.305 mg/mL，这表明果皮多酚对羟基自由基清除效果相对显著。

图5 西番莲果皮多酚清除羟基自由基能力Fig.5 The ability of polyphenols from passiflora edulis rind to scavenge hydroxyl radicals

2.4.2 清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一种以氮为中心的活泼自由基，在有抗氧化剂存在时能迅速地与之进行配对并被其清除，因此是鉴定抗氧化能力实验室常用的研究方法[23]。以VC溶液为对照，果皮多酚对DPPH自由基清除能力见图6。

图6 西番莲果皮多酚清除DPPH自由基能力Fig.6 Polyphenols from passiflora edulis rind scavenging DPPH free radicals

从图6可知，多酚样品液和VC溶液均具有清除DPPH自由基作用，两种溶液质量浓度与DPPH清除率具有良好的线性关系，VC的抗氧化能力比多酚样品液强，欲达到相同的DPPH清除率，多酚样品的质量浓度约为VC溶液的40倍。从IC50值来看，多酚样品溶液和VC溶液的IC50值分别为0.328、0.007 mg/mL，可见在该体系下，多酚清除自由基效果较不理想。

2.4.3 清除超氧阴离子自由基能力

O2-·属于活性氧自由基，与羟基自由基相比活性较低，其自氧化反应在320 nm处产生中间产物，加入抗氧化剂后产物的生成受到抑制，吸光度下降[15]，试验结果如图7所示。

图7 西番莲果皮多酚清除超氧阴离子自由基能力Fig.7 The ability of polyphenols from passiflora edulis rind to scavenge superoxide anion free radicals

结果表明，在320 nm下测多酚样品液及VC溶液吸光度，两种溶液的吸光度在0.2～0.8之间线性良好，多酚提取液清除率曲线拟合度为R2=0.991 6，VC清除率拟合曲线拟合度为R2=0.993 7。由图7可得，在该体系下，两种溶液均对邻苯三酚生成中间产物有抑制作用，阻碍了邻苯三酚自氧化作用，在同质量浓度下，多酚提取液的抗氧化能力较样品液强，多酚抗氧化效果较为稳定，呈平稳趋势增长。本试验体系下，多酚提取液的IC50值为0.696 mg/mL，VC溶液的IC50值为15.850 mg/mL。总体而言，多酚的抗氧化效果较VC好。

2.5 西番莲果皮多酚对花生油抗氧化的作用

花生油富含不饱和脂肪酸，营养价值高，但也易于发生氧化产生异味，并生成对人体有害的过氧化物，而多酚作为常见的抗氧化剂，可被添加到油脂中防止油脂酸败[24]。本试验中，西番莲果皮多酚对于花生油的抗氧化效果如图8。

由图8试验结果分析，西番莲果皮多酚对油脂有一定的抗氧化作用，且随着果皮多酚浓度的增大而增强，但总体抗氧化效果略差于儿茶素。在第1天，果皮多酚和儿茶素均抑制了花生油的氧化作用，儿茶素的抑制作用强于果皮多酚。随着时间的延长，果皮多酚对花生油的抗氧化作用平缓增加，儿茶素增长较为不明显。在第5天，果皮多酚抗氧化作用开始变得不显著，添加了不同浓度果皮多酚的油样POV值降到了4 mmol/kg～5 mmol/kg，这可能是由于果皮多酚对活性氧自由基捕捉速度减慢，使其清除自由基的能力下降。儿茶素在第4天抗氧化效果开始明显下降，第5天时添加了0.25%的儿茶素抗氧化作用与添加了0.75%的多酚相近，后续效果平缓。以儿茶素为对照，西番莲果皮多酚对花生油的抗氧化效果虽不及儿茶素，但也具有较好的保护作用，0.75%的用量可使花生油在试验条件下48 h内保持POV值基本稳定不变，氧化抑制率达到33.33%，且抗氧化作用随用量的增大而增强。

图8 西番莲果皮多酚对花生油的抗氧化研究Fig.8 Antioxidant activity of passionflower peel polyphenols on peanut oil

3 结论

紫果西番莲果皮中含有丰富的多酚物质，本试验通过液质联用分析方法定性分析了紫果西番莲果皮乙醇提取物中多酚的种类，鉴定出13种多酚物质，为西番莲果皮多酚的深入研究提供了参考。以VC为参照，选择清除羟基自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基能力3个项目，分析比较了西番莲果皮多酚提取物的体外抗氧化活性强弱，结果表明，在同等质量浓度下，果皮多酚提取物对羟基自由基的清除能力优于VC，对DPPH自由基清除能力弱于VC，对超氧阴离子自由基清除率优于VC。为了进一步评价西番莲果皮多酚抗氧化性质的应用潜在价值，以花生油为抗氧化保护对象，对比了西番莲果皮多酚与抗氧化性质较强的儿茶素对花生油的抗氧化作用，结果显示，同等用量情况下，西番莲果皮多酚对花生油的抗氧化作用虽不及儿茶素，但也有较好的抗氧化效果，0.75%的用量可使花生油在试验条件下48 h内保持POV值基本稳定不变。由此可见，紫果西番莲皮多酚物质具有较好的抗氧化活性，可作为抗氧化剂应用于油脂的抗氧化。