高效液相色谱-二极管阵列检测法测定茵陈蒿散中的栀子苷

林仙军，王 彬，陈晓林

(浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 311101)

茵陈蒿散由茵陈、栀子和大黄通过粉碎、过筛、混合制得，处方的量分别是茵陈120 g、栀子60 g和大黄45 g。该散剂为浅棕黄色的粉末，气微香，味微苦。具有清热利尿[1]、解毒退黄[2]、清肝利胆[3]的作用，临床主要用于治疗湿热黄疸[4-5]。该品种质量标准收载于《中国兽药典》2015年版二部[6]，采用显微法对茵陈、栀子和大黄进行鉴别。采用薄层色谱法分别鉴别大黄和栀子[7]，用到乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、丙酮、甲酸乙酯等溶剂，环境污染严重，操作繁琐。栀子是茵陈蒿散的臣药，栀子苷是栀子的主要有效成分之一，具有泻火除湿、清热利尿[8]、凉血解毒[9]、保肝利胆[10]、抗氧化[11]、抗炎镇痛、降血压等作用[12]。采用标准未对栀子苷进行定量检测，不能全面评价药物，质量控制方法不完善。

高效液相色谱法快捷、准确、灵敏度高，定性和定量均准确。尤以高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)结合了光谱扫描和数据库功能，定性更准确，在兽药检验中将发挥越来越大的作用。本试验采用HPLC-DAD法对茵陈蒿散中的栀子苷检测的方法进行了研究，为茵陈蒿散质量控制提供数据。

1 仪器与材料

1.1仪器 高效液相色谱仪，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型DAD检测器；XS205电子天平(Mettler公司)；DELTA320 pH计(Mettler公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试剂与材料 乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸、盐酸、氢氧化钠、30%双氧水均为分析纯;实验用水为milli-Q超纯水。栀子苷对照品，来源中国食品药品检定研究院，批号110749-201115，含量99.7%。茵陈蒿散，来源浙江博信药业股份有限公司，批号为20181001、20181002和20181003；来源杭州爱力迈动物药业有限公司，批号为T191001、T191002和T191003。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的配制 取栀子苷对照品7.00 mg，置50 mL量瓶中，加水适量，超声处理使溶解并稀释至刻度，摇匀制成对照品储备液。

2.2供试品溶液的配制 精密称取供试品约0.5 g于100 mL量瓶中，水适量，超声处理20 min，用水稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.3色谱条件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱程序见表1；进样量10 μL，柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min，用二极管阵列检测器进行扫描，扫描范围为200～400 nm，记录240 nm波长处的色谱图。该色谱条件下栀子苷色谱峰良好。对照品溶液色谱图见图1，对照品溶液光谱图见图2；供试品溶液(T191101)色谱图见图3，供试品溶液(T191101)中栀子苷光谱图见图4。

图1 栀子苷对照品溶液色谱图

图2 栀子苷对照品溶液光谱图

图3 茵陈蒿散(T191101)色谱图

图4 茵陈蒿散(T191101)中栀子苷光谱图

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.4方法学考察

2.4.1线性范围考察 精密量取对照品储备液适量，用水稀释2倍、5倍、10倍、20倍和50倍。制成相应浓度的系列标准品溶液，从低浓度到高浓度依次进样分析，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程和相关系数，2.790～139.6 μg/mL，Y=11.55526X-10.36225，相关系数为0.99989。

2.4.2精密度试验 取批号为T191101茵陈蒿散供试品溶液，按上述色谱条件重复连续进样6次，测得栀子苷峰面积相对标准偏差为1.2%。表明此方法的仪器精密度符合要求。

2.4.3稳定性试验 取批号为T191101茵陈蒿散供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h进行测定，测得栀子苷峰面积相对标准偏差为0.7%。表明供试品溶液稳定性良好。

2.4.4方法专属性 取T191101茵陈蒿散各0.5 g，置10 mL量瓶中，分别加1 mol/L盐酸溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液和5%过氧化氢溶液各1 mL，放置1 h，用50%甲醇溶液定容，依法测定。栀子苷在盐酸溶液和过氧化氢溶液均稳定，峰面积减少在3%以内；在氢氧化钠溶液中，峰面积减少约50%。

2.4.5加样回收率试验 取栀子苷适量，加甲醇1 mg，配制成约每毫升的加样回收率试验溶液。另取批号为T191101的茵陈蒿散样品6份，各0.25 g，分别精密加入加样回收率试验溶液各2.5 mL，置100 mL量瓶中，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下条件检测，结果扣除茵陈蒿散样品原有栀子苷的量，计算平均回收率为98.9%，RSD为1.2%。

2.4.6实际样品的测定 取批号为T191101、T191102、T191103、20181001、20181002和20181003的茵陈蒿散3个平行，各0.5 g，按照2.2项下方法配制供试品溶液，依法检测，记录色谱图，按外标法计算栀子苷含量，结果见表2。

表2 样品中含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1提取溶剂的选择 栀子苷易溶于水，溶于乙醇、甲醇，不溶于石油醚。本试验选择了水、甲醇、50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈超声20 min超声提取，结果见图5，图中序号1、2、3、4、5分别对应以上5种提取溶剂，栀子苷在50%甲醇、水、50%乙醇和50%乙腈中提取效率均较好，在纯甲醇中提取效率较差。50%乙腈提取后，峰型较差。50%乙醇和50%甲醇提取杂质稍微多一些。因此，综合考虑，选择水作为茵陈蒿散供试品的提取溶剂。在这基础上，进行超声时间的确认，试验分别超声5 min、10 min、15 min和20 min，结果检测出栀子苷的含量分别是12.25 mg/g、12.28 mg/g、12.35 mg/g和12.37 mg/g，表明栀子苷在水中超声非常容易溶解，5 min以后无显著差异。因此，为了确保提取充分，选择超声时间为10 min。

图5 提取溶剂对含量的影响

3.2检测波长的选择 本试验采用二极管陈列检测器对栀子苷进行全波长扫描，结果发现，栀子苷在240 nm波长有最大吸收，综合考虑，栀子苷的响应及杂质干扰因素，选择240 nm作为检测波长。

3.3流动相的选择 考察了乙腈与0.01%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.4%磷酸溶液作为流动相，各流动相保留时间和峰形一致，而乙腈-0.4%磷酸溶液pH值为1.5，乙腈-0.2%磷酸溶液pH值为1.7，pH值小于2.0对色谱柱损害较大；而乙腈-0.05%磷酸溶液pH值为2.3左右。因此，选择0.05%磷酸溶液-乙腈作为流动相，调节流动相比例，栀子苷和其他组分分离度达到1.5，保留时间比较合适，确定梯度洗脱程序。

3.4定性定量 供试品溶液色谱图中如出现和栀子苷对照品溶液色谱图中保留时间一致的色谱峰，保留时间差异不大于±5%，且为单一物质峰；在200～400 nm波长范围内，两者紫外光谱图匹配，且最大吸收波长一致，差异不大于±2 nm，则判定为检出栀子苷。

3.5小结 本文采用HPLC-DAD法对茵陈蒿散中栀子苷进行检测，对提取溶剂、提取方式、检测波长、专属性和色谱条件等进行研究，方法定性定量准确，适用于茵陈蒿散中栀子苷的含量检测。