碳离子束辐照对火龙果种子萌发、存活率及幼苗生长的影响

武志江 梁桂东 廖以金 黄黎芳 黄凤珠 陆贵锋 陈东奎 邓海燕

摘  要：為探究碳离子束辐照对火龙果种子的损伤效应并且确定适宜的诱变辐照剂量，以红肉火龙果种子为试材，采用5个不同剂量（0、15、30、45、60 Gy）的碳离子束¹²C⁶⁺进行辐照处理，观察其对火龙果种子萌发、存活率及幼苗生长的影响。结果表明，¹²C⁶⁺离子束在辐照剂量0～60 Gy内大多数种子均能正常萌发，对发芽率的影响不大，而对发芽势和发芽指数存在一定的抑制作用;对幼苗苗高具有显著的促进作用，而对根长、子叶长和宽均呈现不同程度的抑制作用。碳离子束辐照对火龙果幼苗存活率的影响具有极显著的剂量效应，随剂量升高而极显著下降。火龙果种子碳离子束辐照的半致死剂量（LD₅₀）为24 Gy，建议适宜辐照剂量范围为15～30 Gy。

关键词：碳离子束;火龙果;种子萌发;幼苗生长;半致死剂量中图分类号：S667.9      文献标识码：A

Effect of Carbon Ion Beams Irradiation on Seed Germination， Survival and Seedling Growth of Hylocereus polyrhizus

WU Zhijiang¹， LIANG Guidong¹， LIAO Yijin²， HUANG Lifang¹， HUANG Fengzhu¹， LU Guifeng¹， CHEN Dongkui¹， DENG Haiyan^1*

1. Horticultural Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China; 2. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： In order to explore the damage effect of carbon ion beams irradiation on seeds and determine the suitable mutagenic irradiation doses， the effects of carbon ion beams on seed germination， survival and seedling growth were investigated by irradiating the dry seeds of red pitaya （Hylocereus polyrhizus） at various doses of¹²C⁶⁺ion beams （0， 15， 30， 45 and 60 Gy）. The results showed that most of the seeds could germinate normally at the irradiation doses ranging from 0 to 60 Gy， and the effects of carbon ion beams on the germination rate were not significant， but some certain inhibitory effects on germination potential and germination index were observed. It could significantly promote the shoot height， but inhibit the radicle length， cotyledon length and width to varying degrees. Carbon ion beams irradiation had a very significant dose effect on the survival rate of the seedlings which significantly decreased with the irradiation dose. The semi-lethal dose （LD₅₀） of the seeds of red pitaya irradiated by carbon ion beams was 24 Gy. The recommended irradiation doses is ranged from 15 to 30 Gy. Those results would provide dose references and guidance for the subsequent study of carbon ion beams mutation breeding of pitaya.

Keywords： carbon ion beams; pitaya; seed germination; seedling growth; semi-lethal dose

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.016

火龙果属仙人掌科（Cactaceae）量天尺（Hylocereus）或蛇鞭柱属（Selenicereus）多年生肉质藤蔓型植物，果实外形独特，具有较高的营养价值、药用价值以及观赏价值，原产于墨西哥南部及中美洲诸国的太平洋沿岸地区。我国海南、广西等地最早引入火龙果进行种植，经过数年的常规育种手段（芽变选种、实生选种、杂交选育等）选育出一些优良品种。种质资源是作物育种工作的物质基础，由于国内火龙果种质资源存在严重的遗传基础狭窄、原生种匮乏等问题，所以严重阻碍了火龙果的育种效率，导致目前生产上火龙果主栽品种类型单一，性状趋同化严重，难以满足市场对品种多样化的需求。因此，运用各种技术手段如物理诱变、化学诱变、分子生物学技术等对现有火龙果种质进行创新和改良，拓宽育种材料的遗传基础，是加快培育火龙果新品种的有效途径之一。

重离子（荷能重的带电粒子）作为一种新的诱变源，相比γ射线、X射线、β射线、中子和电子束等传统诱变源具有传能线密度（LET）和高生物学效应（RBE）等特点，因其具有突变率高、诱变谱广等优点，尤其对改良果实成熟期、果实品质、植株抗病性等性状效果显著^[1]，越来越多地被应用于高等植物的诱变育种研究中^[2-6]。利用重离子辐射诱变已使多种作物成功地获得了包括早熟、矮化、抗逆、优质的突变体^[4]。目前果树的诱变育种研究多采用⁶⁰Co-γ射线作为辐射源^[7-12]，而重离子辐射诱变技术在果树上的研究尚处于起步阶段^[13]，尤其是热带果树的研究仍是空白。目前有关火龙果辐射诱变的研究较少，仅有邓仁菊等^[14-15]利用⁶⁰Co-γ射线辐射和EMS（甲基磺酸乙酯）对火龙果幼苗和枝条进行诱变育种研究。

基于前期试验结果，本研究选定在0～60 Gy范围内设定不同剂量梯度的¹²C⁶⁺离子束辐照，研究其对火龙果种子萌发、幼苗生长发育以及存活率的影响，探究重离子辐照剂量与致死率的效应关系，并计算其半致死剂量，为构建火龙果突变体库提供辐射剂量参考，为重离子辐射诱变育种工作提供理论基础研究和技术指导。

1  材料与方法

1.1材料

供试种子来源于红肉火龙果（Hylocereus polyrhizus）品种‘桂红龙2号，其千粒重约为1.3 g。取成熟火龙果果肉，放入尼龙网袋中，用手揉搓使果肉与种子分离，一边揉搓一边用自来水冲洗掉果肉。取出倒入水中，将水中漂浮的种子和少量果肉倒掉，剩下的种子经风干处理，即得供试种子。储藏前去除杂质、不饱满、干瘪或破损的种子，选取颗粒饱满，大小均一的种子用于碳离子束¹²C⁶⁺辐照试验。

1.2方法

1.2.1  辐照处理  实验在中国科学院近代物理研究所兰州重离子加速器国家实验室重离子研究装置（HIRFL）生物辐射终端进行。所用碳离子束¹²C⁶⁺初始能量为80 MeV/u，经由不锈钢窗，Mylar膜和空气照射到种子表面。火龙果种子平铺于Corning培养皿（直径为35 mm）中，种子平均厚度为5 mm。辐照实验在常温常压下进行，样品更换和数据获取由计算机控制。基于前期辐照诱变研究，辐照剂量分别设置为0（CK）、15、30、45和60 Gy，剂量率为40 Gy/min。辐照试验重复3次。

1.2.2  发芽试验  发芽试验采用完全随机设计，3次重复。辐照火龙果种子用10%次氯酸钠灭菌后，用无菌水冲洗3遍，置于无菌水中浸种6 h。在发芽盒（底部为正四邊形，边长为12 cm）底部铺放两层滤纸，用少量ddH₂O将滤纸湿润，将经过预处理的火龙果种子均匀地摆放在双层滤纸上进行发芽试验，然后置于（28±1）℃的人工气候箱中进行恒温培养试验，光周期为12 h，光照强度2200 lx。每天加入适量的无菌水以保持滤纸湿润。从种子置床之日开始，每天观察并记录各处理萌发的种子数（以种子发芽露白，胚根长度不小于种子半径为准），直至连续3 d无种子萌发为止，最后计算每天发芽率、终发芽率、发芽势、发芽指数。

发芽率=当天累计发芽种子数/供试种子数× 100%;

终发芽率=第11天总发芽种子数/供试种子数× 100%;

发芽势=第4天发芽种子数/供试种子数× 100%;

发芽指数=∑（Gt/Dt）（Gt为t日当天的发芽数，Dt为相应的发芽日数）。

1.2.3  幼苗生长发育及存活试验  发芽结束后，幼苗再培养12 d，期间每天观察幼苗的生长情况，最后从每皿中随机选择10株幼苗测定其苗高（从基部到子叶的距离，即下胚轴高度）、根长、子叶长、子叶宽。测定结束后，将幼苗移栽到穴盆（直径6 cm，高10 cm）中，置于温室中继续培养约30 d，直至不再冒出上胚轴幼芽，即露芯为止，最后统计正常健康的幼苗数，计算幼苗存活率以及作用强度（大于0为促进作用;小于0为抑制作用）。

幼苗存活率=健康存活幼苗数/供试种子数× 100%;

作用强度=（处理-对照）/对照×100%。

1.3数据处理

采用Excel 2010软件进行数据整理，SPSS 22.0软件进行统计分析，采用Duncans新复极差法进行多重比较。

2  结果与分析

2.1碳离子束辐照对火龙果种子萌发特性的影响

不同辐照处理的种子发芽率随置床时间均呈“S”型变化趋势（图1），经历了快增期、缓增期和稳定期，均在置床2 d后进入快增期，5 d趋于稳定，8 d时发芽率最高。与对照（CK）相比，重离子辐照对种子发芽过程的前期（1～3 d）影响较大，后期（4～10 d）影响较小，差异不显著（图1）。重离子辐照对种子初始萌发期、发芽持续时间和终发芽率无显著影响，各处理均在种子置床后第2天开始萌发，第11天发芽全部结束，从萌芽到发芽结束持续9～10 d，终发芽率均达到97%以上（图1）。重离子辐照对种子的发芽势和发芽指数均有显著影响（P<0.05），均表现出不同程度的抑制作用（图2、图3）。随着辐照剂量的升高，重离子对种子的发芽势和发芽指数的抑制作用总体上均呈现增强趋势，当剂量较低，仅为15 Gy时，对发芽指数已表现显著的抑制作用（P< 0.05），发芽指数较对照降低了5.4%（图2），而对发芽势来说，当剂量较低（0～30 Gy）时，抑制作用不显著，当剂量升高至45 Gy时，抑制作用达到显著水平（P<0.05），较对照降低了12.9%（图2）。

不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

Different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05; different uppercase letters indicate highlysignificant difference atP<0.01.

2.2碳离子束辐照对火龙果幼苗生长发育的影响

火龙果种子经不同剂量¹²C⁶⁺离子束辐照后，其幼苗早期的生长发育受到了极显著影响（P< 0.01），存在剂量梯度变化（表1）。随着辐照剂量的升高，火龙果的幼苗苗高呈现先升后降的“抛物线”变化趋势（图3）。与对照相比，辐照剂量在60 Gy内的重离子均对苗高具有显著促进作用（P<0.05），其促进程度随着辐照剂量的升高逐渐增强，在30 Gy时达到最高，较对照极显著增加了62.1%（P<0.01），而后促进作用逐渐减弱，60 Gy时最低（P<0.05）（图3）。有趣的是，重离子辐射可使火龙果子叶的长和宽下降，浓度越高，降低幅度越大，当浓度为30 Gy时表现出显著降低（表1）。这表明重离子在低剂量时对火龙果子叶的抑制强度不大，高浓度则表现出显著的抑制作用，并随剂量升高而增强。

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著（P< 0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

Note： Different lowercase letters in the same column. indicate significant difference among different treatments （P<0.05）; and different uppercase letters in the same row indicate highly significant difference among different treatments （P<0.01）.

與苗高的变化趋势不同，幼苗根长随着辐照剂量的升高而一直下降（图3），这表明辐照剂量在60 Gy内的重离子均对根长具有抑制作用。当辐照剂量达到30 Gy时抑制作用表现显著（P< 0.05）且抑制强度随剂量而升高。辐照剂量为60 Gy的重离子对火龙果幼根的抑制作用最强，抑制强度达68.0%以上（P<0.01）（图3）。

综上所述，¹²C⁶⁺离子束辐射剂量在60 Gy内对火龙果早期幼苗苗高具有显著促进作用，而对幼苗子叶和幼根的生长具有抑制作用。

2.3碳离子束辐照对火龙果幼苗存活率的影响及半致死剂量计算

在试验中发现，经辐照处理的火龙果幼苗在生长早期根系尽管受到不同程度的抑制，但并未出现衰亡的症状，随着生育进程的推进，一些幼苗无法冒出上胚轴幼芽，即无露芯现象，根系逐渐死亡，茎基部发黑腐烂，地上茎叶部分因茎基部死亡而断裂倒伏（图4）。

说明：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著（P< 0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

Note： Different lowercase letters in the same column indicate signi ficant difference among different treatments （P<0.05）; and different uppe rcase letters in the same column indicate highly significant difference among different treatments （P<0.01）.

苗存活率隨辐照剂量升高而极显著下降。当辐照剂量为60 Gy时，各重复仅存有1或0个幼苗成活，平均幼苗存活率仅为（0.7±0.6）%（表2），因此，进行回归分析时因其成活率极低，仅采用其他4个剂量点的数据进行回归分析，求得直线回归方程为y=-2.0889x+98.5（R²=0.9778），利用回归方程导出火龙果的半致死剂量为24 Gy（图5）。

3讨论

重离子束经辐照注入到生物体后通常会引发当代（M1代）损伤效应，包括原初损伤和遗传变异^[16-17]，原初损伤主要是生理及形态发生变化，并不能遗传给下一代（M2代）;而遗传变异是通过单链DNA或双链DNA的断裂、片段的插入缺失、DNA修复等引发的基因突变进而影响性状的改变，能够稳定遗传^[18-19]。重离子束辐照对植物生长发育的影响往往具有双重效应，低剂量常表现为刺激/促进效应，而高剂量表现抑制效应^[20-21]。在本研究中，0～60 Gy剂量的¹²C⁶⁺离子束辐照对火龙果幼苗苗高具有“抛物线”型促进效应，呈现明显的“低促高抑”的趋势。这一结果跟刘青芳等^[22]研究中小麦苗高的变化情况类似。而火龙果幼苗的其他生物学指标包括根长和子叶在相同的剂量范围内并未表现“低促高抑”的效应，而是随着辐照剂量的升高呈持续下降的趋势。这可能与本试验设定的最低剂量限度有关，根长和子叶在15 Gy与对照之间并无显著差异，因此推断碳离子束辐照很可能在剂量0～15 Gy内存在促进作用。本研究发现，火龙果幼根的生长对碳离子束辐照更为敏感，抑制程度较地上部分（包括下胚轴和子叶）的生长更为严重，这一结果跟陈玉泽等^[18]的一致。这可能是重离子辐照对种子胚的胚根和子叶的损伤程度较胚轴大造成。种子的胚性细胞被认为是离子束辐照生物学效应的靶细胞^[23]。这些细胞的损伤可能导致种子萌发及幼苗生长发育受到影响。另外，本研究还发现，0～60 Gy剂量范围的重离子辐照对火龙果种子萌发的影响较小，尽管种子发芽过程中发芽速度和整齐度（发芽势和发芽指数表征）受到一定程度的抑制，但大多数种子均能够正常萌发，其终发芽率与对照之间差异不显著，这与刘青芳等^[22]用¹²C⁶⁺离子束辐照小麦和罗春华等^[24]辐照3种盐生植物的结果相似。

关于辐射诱变育种的适宜辐照剂量的确定，M1代的损伤指标（发芽势、存活率等）因其与突变率之间有一定关系，并与辐射敏感性相对应，所以常作为确定适宜诱变剂量的参数^[25]。近年来，通常采用植株存活率50%左右的剂量作为适宜辐照剂量。另有学者选用半致死剂量上下相差20%的剂量范围，作为产生更多有益突变的适宜辐照剂量。在本研究中，火龙果幼苗在生长前期未表现死亡症状，而在生长后期相继出现死亡，因此存活率更适合表征火龙果种子经辐照诱变后幼苗最终成活的参数。由火龙果幼苗存活率与辐照剂量的回归方程得出火龙果的半致死剂量为24 Gy（R²=0.9778），这与番茄种子（LD₅₀为30 Gy左右）^[26]和菘蓝种子（LD₅₀为35 Gy）^[27]的碳离子束辐照半致死剂量较为接近，另有文献报道小麦种子的碳离子束辐照半致死剂量为55 Gy^[22]，大豆种子为100 Gy左右^[3]，这种剂量的差别可能是由于辐照率大小或种子材料不同所造成。不同种属种子的自身特性（如种子大小、种皮厚度或硬度等）不同，对碳离子辐照的耐受能力不同，所受的损伤类型和程度也不尽相同，从而导致半致死剂量不同。

综合考虑本研究与前期试验（数据未发表）的结果，建议采用15～30 Gy为适宜辐照剂量，超过45 Gy则损伤增大，存活率较低（仅为7.7%），不利于筛选有益突变材料。不同品种的火龙果种子辐照敏感性可能会有差异，但辐照剂量不应低于15 Gy或高于45 Gy。下一步继续观测突变体材料的突变率，获得遗传稳定的农艺性状变异的火龙果新种质，进而研究其辐照诱变机理。

参考文献

[1] 王连铮， 裴颜龙， 赵荣娟， 等. 大豆辐射育种的某些研究[J]. 中国油料作物学报， 2001， 23（2）： 1-5.

[2] 卫增泉， 颉红梅， 梁剑平， 等. 重离子束在诱变育种和分子改造中的应用[J]. 原子核物理评论， 2003， 23（1）： 38-41.

[3] 张秋英， 余丽霞， 李彦生， 等. 重离子束辐照大豆籽粒当代效应的初步研究[J]. 大豆科学， 2013， 32（5）： 587-590.

[4] 赵连芝， 王  勇， 甄东升， 等. 春小麦突变新品种——“陇辐2号”[J]. 核农学报， 2005， 19（1）： 80.

[5] 董喜存， 李文建. 碳离子束辐照对甜高梁节间参数的影响[J]. 辐射研究与辐射工艺学报， 2008， 26（5）： 314-316.

[6] 余丽霞， 李文建， 董喜存， 等. 碳离子辐射大丽花矮化突变体的RAPD分析[J]. 生物物理学报， 2009， 25（S1）： 486-487.

[7] 廖安红， 陈  红. 不同⁶⁰Co-γ射线辐照剂量对刺梨幼苗生长及生理特性的影响[J]. 分子植物育种， 2016， 14（3）： 742-748.

[8] 杨  振， 李  疆， 梅  闯， 等.⁶⁰Co-γ辐照对库尔勒香梨枝条当代诱变效应初报[J]. 新疆农业科学， 2012， 49（5）： 848-855.

[9] 何  平， 李林光， 王海波， 等. 辐照处理对苹果嫩枝变异效应研究[J]. 核农学报， 2016， 30（7）： 1249-1254.

• 何  平， 王玉霞， 李林光， 等. ⁶⁰Co-γ辐射对嘎拉苹果枝条诱变效应的研究[J]. 山东农业科学， 2016， 48（2）： 38-40.
• 黄凤珠， 朱建华， 彭宏祥， 等. 不同剂量⁶⁰Co-γ射线辐照处理对龙眼种子萌芽生长的影响[J]. 中国南方果树， 2013， 42（1）： 69-71.
• 李  静， 卢晓鹏， 邓钢桥， 等. ⁶⁰Co-γ射线对枳生物性状和分子特性的影响[J]. 核农学报， 2015， 29（7）： 1239-1245.
• 丁增成， 徐义流. 离子注入对梨、桃、葡萄生长发育的影响[J]. 安徽农业科学， 1993， 21（4）： 382.

[14] 邓仁菊， 范建新， 蔡永强， 等.⁶⁰Co-γ射线辐照和EMS处理对火龙果成活率及幼苗生长的影响[J]. 激光生物学报， 2011， 20（1）： 22-26， 31.

[15] 邓仁菊， 范建新， 王永清， 等. 火龙果幼苗离体辐射诱变及其对低温胁迫的生理响应[J]. 热带作物学报， 2018， 39（2）： 260-266.

[16] 周利斌， 李文建， 曲  颖， 等. 离子束辐照结合组织培养在植物诱变中的研究进展[J]. 辐射研究与辐射工艺学报， 2007， 25（4）： 232-236.

[17] 冯  慧， 骆善伟， 杜  艳， 等. 氩离子束辐照拟南芥干种子的生物学效应[J]. 辐射研究与辐射工艺学报， 2016， 34（1）： 33-40.

[18] 陈玉泽， 杜  艳， 余丽霞， 等. 不同LET碳离子束辐照拟南芥干种子的当代损伤效应[J]. 原子核物理评论， 2016， 33（4）： 494-499.

[19] 刘建光， 王永强， 赵贵元， 等. 重离子辐照诱变育种应用及其生物学效应研究进展[J]. 作物杂志， 2016（3）： 12-16.

[20] Wang L， Ma R N， Yin Y，et al. Antioxidant response ofArabidopsis thalianaseedlings to oxidative stress induced by carbon ion beams irradiation[J]. Journal of Environmental Radioactivity， 2018， 195： 1-8.

[21] Wang L， Ma R N， Yin Y，et al. Role of carbon ion beams irradiation in mitigating cold stress inArabidopsis thaliana[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2018， 162： 341-347.

[22] 刘青芳， 余丽霞， 杜  艳， 等.¹²C⁶⁺离子束辐照对小麦种子萌发、幼苗生长及存活的影响[J]. 辐射研究与辐射工艺学报， 2013， 31（1）： 26-30.

[23] Qin H L， Xue J M， Lai J N，et al. Energy related germination and survival rates of water-imbibed Arabidopsis seeds irradiated with protons[J]. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B： Beam Interactions with Materials and Atoms， 2006， 245（1）： 314-317.

[24] 罗春华. 碳离子束和电子束辐照对3种盐生植物种子诱变效应的研究[D]. 兰州： 甘肃农业大学， 2015.

[25] 刘智全， 谷卫彬， 李文建. 重离子束辐照对甜高粱幼苗存活率及抗氧化酶活性的影响[J]. 安徽农业科学， 2012， 40（25）： 12 454-12 456， 12 604.

[26] 司  婧， 张  红.¹²C^{6 +}离子束辐照番茄种子当代效应[J]. 原子核物理评论， 2011， 28（3）： 349-353.

[27] 陸锡宏， 石广亮， 李雪虎， 等.¹²C⁶⁺离子束辐照菘蓝干种子当代效应[J]. 原子核物理评论， 2013， 30（4）： 477-482.