采后菠萝黑心病发病过程中活性氧的代谢途径

常金梅 何咏 张鲁斌

摘  要：為了探讨采后菠萝黑心病发病过程中活性氧的代谢途径，以‘巴厘菠萝为材料，将其贮藏在25 ℃条件下，观察黑心病的发病情况，每隔3 d对整果果肉以及健康部位和患病部位的果肉组织进行取样，测定果实发病率以及果肉褐变度，对发病过程中脂氧合酶（LOX）活性和丙二醛（MDA）含量进行了测定，同时对活性氧代谢起关键作用的抗坏血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、类黄酮含量以及活性氧清除相关酶（POD、CAT、SOD）活性进行了测定。结果表明，菠萝果实在贮藏第6天开始发病，到15 d时，发病率为100%，褐变度在第6～9天时增长最快;在黑心病发病过程中，与健康部位相比，患病组织伴随着LOX活性的升高，MDA的积累，同时出现AsA的下降、类黄酮含量的显著增加，且患病组织POD、CAT酶活性快速下降，但谷胱甘肽含量和SOD酶活性几乎没有变化。由此可推断，在采后菠萝黑心病发病过程中，AsA、类黄酮、POD、CAT在活性氧代谢中起关键作用。

关键词：菠萝;黑心病;活性氧代谢中图分类号：S668.3      文献标识码：A

Metabolism of Reactive Oxygen Species During Development of Black Heart Disease in Post-harvest Pineapple

CHANG Jinmei^1，2，3， HE Yong¹， ZHANG Lubin^1，2，3*

1. Lingnan Normal University， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Hainan Province for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. Jiaying University / Guangdong Provincial Key Laboratory of Conservation and Precision Utilization of Characteristic Agricultural Resources in Mountainous Areas， Meizhou， Guangdong 514000， China

Abstract： In order to explore the metabolism pathway of reactive oxygen species （ROS） related to the development of black heart disease in postharvest pineapple， ‘Paris pineapple as the material was stored at room temperature and observed for the incidence of black heart disease. The pulp along the equator and the pulp of healthy and diseased parts were sampled separately every 3 days. The incidence of black heart disease and the browning degree of pulp were tested. At the same time， the activities of lipoxygenase （LOX）， and the key enzymes of ROS metabolism （POD， CAT， SOD）， and the contents of malondialdehyde （MDA）， ascorbic acid （AsA）， flavonoids and glutathione （GSH） were tested during the course of the storage. The results showed that the black heart disease of pineapple appeared at the 6th day and the incidence rate increased to 100% at the 15th day. From the 6th day to the 9th day， the browning was the fastest. Compared with healthy parts， the diseased tissue was accompanied by increase of LOX activity and MDA accumulation， significant decrease in AsA content and POD， CAT activities， and rapid increase in flavonoid content. The glutathione content and SOD activity did not change significantly. It could be inferred that AsA， flavonoids， POD and CAT play key roles in ROS metabolism during the development of black heart disease in post-harvest pineapple.

Keywords： pineapple; black heart disease; metabolism of reactive oxygen

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.020

菠萝[Ananas comosus（L.）Merr]是我国南方的特色水果，也是我国热区主要经济作物。其种植效益和出口贸易情况直接关系到热区农民的经济收入^[1]。采后菠萝主要以鲜果形式在国内市场销售，但采后果实贮藏和运输过程中容易发生黑心病，特别是我国主栽品种‘巴厘，其货架期仅为3～5 d^[2]，之后果肉均出现不同程度的褐色或黑褐色病变，严重影响菠萝产业和进出口贸易发展。菠萝黑心病表现为菠萝外部无任何症状，横剖后果心周围果肉褐变，通常是小果先出现半透明的水渍状或浅褐色的小斑点，随着发病程度的加深，褐色斑点互相联结成一片，并向果髓发展，最终果髓甚至果肉都变为黑褐色^[3-5]。严重影响果实的品质，使果实丧失商品价值，对菠萝产业的发展造成极大的危害^[6-7]。

正常情况下，植物体内活性氧（ROS）的产生和清除保持动态平衡，植物在受到外界非生物逆境胁迫时，会造成细胞代谢的紊乱，诱导产生过量的ROS，引起细胞的氧化伤害，进而破坏细胞正常结构，致使植物体内的生物膜脂过氧化、DNA受损等多种毒害效应发生，最终导致细胞死亡，植物表现出局部坏死、褐变等症状^[8-11]。而植物体内存在一套清除活性氧、防止其毒害的保护体系，包括酶促和非酶促2类防御保护系统，酶促保护系统中的保护酶系主要由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等组成;非酶促即是抗氧化物质，主要包括抗坏血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、类黄酮等^[12-13]。本研究主要针对采后菠萝黑心病发病过程中防御活性氧毒害的保护系统进行了研究，旨在明确黑心病发病过程中起关键作用的活性氧代谢途径，为明确菠萝黑心病发生的生理机制奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

品种为‘巴厘（Ananas comosus‘Comte de Paris），从田间采收七八成熟、大小均匀、无机械损伤的‘巴厘果实，保留顶芽，保留果柄长度1 cm，作为供试材料。将准备好的菠萝置于塑料篮中，用聚乙烯袋包裹塑料篮（不完全密封），在常温（25 ℃）下贮藏，及时观察黑心病的发病情况并取样。

1.2 方法

1.2.1  取样方法  每个处理随机取5个菠萝，横切果实赤道部果肉，厚度约1 cm，去果皮，切小块，液氮速冻，用高速粉碎机碾成粉末状，做标记后于?80 ℃保存;病健部分开取样时，健康部位指赤道部位距果皮0.5 cm果肉，发病部位指果梗与果肉交接处。每处理重复3次。

1.2.2  褐变度和发病率的测定  参照张墨英等^[14]的方法加以改进：称取样品1 g，加入10 mL 95%乙醇，4000 r/min下离心15 min，取上清液在420 nm下测吸光度值，重复3次。发病率测定：每隔3 d测定一次，每次取贮藏菠萝30个切开观察是否发病，发病率=发病果数/菠萝总数×100%。

1.2.3  脂氧合酶活性测定  粗酶液提取：参考陈昆松等^[15]的方法并有所改进，取样品2 g，加入10 mL预冷的pH 7.0，0.05 mol/L的磷酸缓冲液，4 ℃，15 000 r/min离心15 min，取上清液备用。脂氧化酶（LOX）活性测定：先配制反应底物，在100 mg亚油酸钠中加入等质量的TritonX-100及4 mL无氧水，避免产生气泡，用0.5 mol/L NaOH溶液滴定至溶液澄清，定容25 mL，保存于?18 ℃，取反应底物25 μL，加缓冲液2.775 mL，加粗酶液0.2 mL，混匀后于234 nm处测吸光度值，记录1 min内吸光度值的变化。以每分钟每克组织鲜重引起A₂₃₄的变化为一个酶活单位（A /min FW），重复3次。

1.2.4  丙二醛含量测定  参照文献[16]的方法进行测定。测定丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）反应后的OD₅₃₂、OD₆₀₀和OD₄₅₀，按公式C=6.45?（OD₅₃₂?OD₆₀₀）?0.56OD₄₅₀计算MDA（μmol/g）的含量。

1.2.5  抗坏血酸、类黄酮和谷胱甘肽含量的测定  参照贾君^[17]2，6-二氯靛酚的测定方法，取样品1 g，加入40 mL 20 g/L的草酸，摇匀，静置10 min，在冰上过滤，取滤液备用。用已知浓度的标准AsA滴定2，6-二氯靛酚，计算出1 mL 2，6-二氯靛酚相当于AsA的质量，然后取10 mL滤液，用已标定的2，6-二氯靛酚进行滴定，计算出AsA含量，重复3次，单位mg/100 g。类黄酮的含量测定参考张雪辉等^[18]的方法略加修改，取样品2 g加入25 mL甲醇，超声45 min，过滤，取滤液备用。以不同浓度的芦丁标准品溶液做标准曲线，取滤液2.5 mL，加入0.5 mL NaOH，放置5 min，甲醇定容至10 mL，摇匀后在416 nm下测吸光度值，重复3次，单位mg/g。GSH的测定参考翟文慧等^[19]的紫外-可见分光光度法，取1 g样品加入10 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，超声10 min，定容至25 mL，混匀，过滤，留滤液备用。以不同浓度的GSH标准品溶液绘制标准曲线，取1 mL滤液用0.1 mol/L的NaOH溶液定容至10 mL，在230 nm处测定吸光度值，重复3次，单位mg/g。

植物体内存在酶促和非酶促2类防御活性氧毒害的保护系统，其中非酶促保护系统中AsA作为植物体内重要的抗氧化剂，充当抗氧化防御系统中的电子供体，参与催化细胞清除OH^-、O₂^-、H₂O₂等活性氧自由基，抵御自由基对细胞的伤害，同时保护果实内的其他抗氧化成分^[22-26]。类黄酮和GSH均有清除植物体内的自由基及活性氧，保护细胞膜的结构和功能的完整性，增强植物的抗逆性^[27]。本研究结果表明，在0～3 d时，AsA含量较高，黑心病未发生，可能是由于AsA减轻膜的受损伤程度，从第6天开始，AsA含量快速下降，黑心病出现。菠萝果实在患病前后类黄酮含量变化波动比较大，患病之前类黄酮含量保持稳定，患病后受逆境刺激，其含量迅速升高，以清除体内自由基，保护细胞结构和功能的完整性，之后随着褐化的加重，自身生理机能遭到破坏，类黄酮含量下降。而GSH在整个发病过程中基本没有波动，且患病部位和健康部位无差异。酶促保护系统中SOD、CAT和POD为清除活性氧的主要酶，SOD能催化体内过量的O₂^-生成H₂O₂，而CAT和POD催化H₂O₂还原成H₂O^[28]。本研究结果显示，POD、CAT在黑心病发病前后均出现了较大的波动，且患病组织与健康组织的酶活性均出现了较大的差异，推测POD、CAT在病害发生时均作出了响应，而SOD活性在患病部位和健康部位基本没有变化，由此可知，在菠萝黑心病发病过程中，防御活性氧毒害的非酶促保护系统中，AsA和类黄酮起到了关键作用，而酶促保护系统中，POD、CAT起关键作用。

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