复合酶法制备澳洲坚果蛋白肽及其抗氧化活性研究

帅希祥 张明 马飞跃 杜丽清 李秋红 涂行浩

摘  要：本研究以前期制備的澳洲坚果蛋白为原料，经复合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶）酶解制备澳洲坚果蛋白肽，采用水解度为指标，利用单因素试验与正交试验考察各酶解因素对澳洲坚果蛋白水解度的影响，同时通过不同分子量（3、10、30 kDa）的超滤离心管对制备的蛋白肽进行初步的分离，并基于DPPH自由基清除能力对不同分子量的澳洲坚果蛋白肽的抗氧化活性进行评价。结果表明：各酶解因素对复合酶酶解制备澳洲坚果蛋白水解度的影响依次为酶解初始pH>复合酶配比>酶添加量>酶解时间;最佳复合酶酶解条件为复合酶配比1∶5、酶添加量12 000 U/g、酶解液初始pH 9.0、酶解时间360 min，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为21.88%;同时，通过分析不同分子量的澳洲坚果蛋白肽组分发现，不同分子量的澳洲坚果蛋白肽均具有抗氧化活性，分子量在3～10 kDa的肽段组分具有较强的抗氧化能力，其DPPH自由基清除能力达到80.97%，且随着蛋白肽组分浓度的增加，其抗氧化能力也逐渐增强。

关键词：澳洲坚果;蛋白肽;酶解;抗氧化活性中图分类号：S664.9      文献标识码：A

Preparation and Antioxidant Activities of Macadamia Nut Peptides by Combined Enzymatic Hydrolysis

SHUAI Xixiang¹， ZHANG Ming¹， MA Feiyue¹， DU Liqing^1*， LI Qiuhong²， TU Xinghao¹

1. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. School of Chemical and Biological Engineering， Yichun University， Yichun， Jiangxi 336000， China

Abstract： In this paper， the macadamia protein peptide were obtained from the macadamia protein prepared by the enzyme mixture treatment. The effects of various factors on the protein hydrolysis degree of macadamia nuts were investigated by the single factor test and orthogonal test. At the same time， the preliminary separation of the protein peptide was carried out by ultrafiltration centrifuge tubes （3， 10， 30 kDa） with different molecular weights. Then， the antioxidant activity of macadamia nut peptide with different molecular weight was evaluated by DPPH scavenging activity. Results showed that order of the factors was as follows： initial pH > enzyme mixture rate > enzyme concentration > hydrolysis duration. The optimal conditions were as follows： enzyme mixture rate （papain protease and neutral protease） 1∶5， enzyme concentration 12 000 U/g， initial pH 9.0， hydrolysis duration 360 min. Under the optimized condition， the hydrolysis degree of macadamia nut protein was 21.88%. It was found that macadamia nut peptide with different molecular weight had antioxidant activities， and the strongest was the 3～10 kDa peptide. And the DPPH free radical scavenging ability reached 80.97%. As the concentration of the protein peptide component increased， its antioxidant activity also increased.

Keywords： macadamia nut; peptide; enzymatic hydrolysis; antioxidant activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.021

澳洲坚果（Macadamia ternifoliaF. Muell.）别名澳洲核桃、夏威夷果等，属山龙眼科（Prote ac eae）澳洲坚果属^[1-2]。澳洲坚果营养丰富，不含胆固醇，果仁酥脆可口，是世界上品质上乘的可食木本坚果^[3]。目前在中国的云南、广西、贵州等地均有种植，随着我国澳洲坚果的大量种植，澳洲坚果资源越来越丰富。但目前，澳洲坚果主要以壳果和果仁等初级加工产品的形式出售，一些次果主要用于榨油，榨油后的副产物澳洲坚果饼粕中含有较高含量的蛋白质（32.25%），且富含有17种氨基酸，总含量为25.05%^[4-6]。目前对于澳洲坚果饼粕蛋白质的研究还只停留在优化提取工艺和评价所得蛋白质的功能特性上^[7]，而对于利用澳洲坚果蛋白来制备生物活性肽及对其性质并没有进行过深入研究。因此，通过生物酶解制备生物活性肽是提高澳洲坚果饼粕利用率的有效途径之一。

生物活性肽是源于蛋白质的多功能化合物，它是由2个或2个以上氨基酸通过肽键连接而形成的化合物，因其组成和排列不同而形成了种类不同的蛋白肽^[8]。蛋白肽除具有易被消化吸收的特性外，还具有许多蛋白质所不具有的特殊生理功能特性，包括抗氧化^[9-11]、降血压^[12]、免疫调节^[13]等。

本研究以前期制备的澳洲坚果蛋白为原料，以水解度为指标，利用单因素和正交试验优化酶解制备澳洲坚果蛋白肽工艺，同时采用超滤技术对制备的澳洲坚果蛋白肽进行初步的纯化，得到4种不同分子量的蛋白肽组分，基于DPPH自由基清除能力对其不同组分抗氧化能力进行评价，以期为澳洲坚果蛋白的高值化利用及开发高效的食品抗氧化剂提供一定的理论依据。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1  材料与试剂  澳洲坚果饼粕由国家重要热带作物工程技术研发中心澳洲坚果果品加工中试基地提供;木瓜蛋白酶（活力≥6000 U/mg）、中性蛋白酶（活力为100 U/mg）、丝氨酸（99.99%）、DPPH（≥97%）;氢氧化钠、盐酸、无水乙醇等均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.1.2  仪器与设备  主要实验仪器与设备如表1所示。

1.2方法

1.2.1  澳洲坚果蛋白制备  采用碱提酸沉法，具体提取工艺条件参照帅希祥等^[14]。

1.2.2  澳洲坚果蛋白酶解工艺流程  澳洲坚果蛋白溶液→90 ℃水浴搅拌10 min→室温冷却→调节溶液pH→加酶→50 ℃恒温水浴酶解→沸水灭酶15 min→高速离心→取上清液→浓缩→冻干→澳洲坚果蛋白肽粉。

1.2.3  澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量的测定  参照Pedroche等^[15]和Nielsen等^[16]报道的o-邻苯二甲醛法（OPA）进行测定。

澳洲坚果蛋白水解度按下列公式计算：

式中，DH为澳洲坚果蛋白水解度（%）;A为复合酶酶解的澳洲坚果蛋白酶解液中蛋白肽含量（μg/g）;B为充分水解的澳洲坚果蛋白中蛋白肽的含量（μg/g）。

1.2.4  澳洲坚果蛋白酶解制备蛋白肽单因素试验  （1）复合酶配比对澳洲坚果蛋白水解度的影响。各取0.30 g 按1.2.1方法制备的澳洲坚果蛋白置于9个100 mL锥形瓶中，各加入30 mL蒸馏水，调节溶液pH 7.0，分别加入3000 U/g复合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1），然后将其置于恒温水浴（50 ℃、800 r/min）中酶解150 min，酶解结束后，将酶解液进行灭酶处理（90 ℃水浴中灭酶15 min），然后在室温下冷却，在8000 r/min下进行高速离心，取上清液，分析不同復合酶配比对澳洲坚果蛋白水解度的影响。

（2）酶解液初始pH对澳洲坚果蛋白水解度的影响。按上述（1）方法配置澳洲坚果蛋白溶液，用1.0 mol/L的氢氧化钠或盐酸分别调节溶液pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入3000 U/g复合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比为1∶4），将其置于恒温水浴（50 ℃、800 r/min）中酶解150 min，酶解结束后，按上述（1）操作处理酶解液，分析不同酶解液初始pH对澳洲坚果蛋白水解度的影响。

（3）酶添加量对澳洲坚果蛋白水解度的影响。按上述（1）方法配置澳洲坚果蛋白溶液，调节溶液pH为8.0，分别加入3000、6000、9000、12000、15000 U/g复合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比为1∶4），将其置于恒温水浴（50 ℃、800 r/min）中酶解150 min，酶解结束后，按上述（1）操作处理酶解液，分析不同加酶量对澳洲坚果蛋白水解度的影响。

（4）酶解时间对澳洲坚果蛋白水解度的影响。按上述（1）方法配置澳洲坚果蛋白溶液，调节溶液pH为8.0，加入12 000 U/g复合酶（木瓜蛋白酶和中性蛋白酶配比为1∶4），将其置于恒温水浴（50 ℃、800 r/min）中酶解不同时间（分别为0、30、60、120、240、360、480 min），酶解结束后，按上述（1）操作处理酶解液，分析不同酶解时间对澳洲坚果蛋白水解度的影响。

1.2.5  澳洲坚果蛋白酶解工艺优化正交试验  在澳洲坚果蛋白酶解单因素试验的基础上，以水解度为指标，选用L₉（3⁴）进行正交试验来优化澳洲坚果蛋白酶解工艺条件，选用因素分别为复合酶配比（A）、酶解液初始pH（B）、加酶量（C）、酶解时间（D），每个因素选择3个水平。

1.2.6  不同分子量澳洲坚果蛋白肽的制备方法  选择截留分子量分别为1、3、10、30 kDa的超滤膜对制备的澳洲坚果蛋白酶解液进行超滤处理，得到4种不同分子量的澳洲坚果蛋白肽组分（1～3、3～10、10～30、30 kDa以上），经冷冻干燥得到不同分子量澳洲坚果蛋白肽粉，备用。

1.2.7  澳洲坚果蛋白肽清除DPPH自由基能力评价  准确称取1.2.6制备的4种蛋白肽粉各0.1000 g，用蒸馏水配置成4 mg/mL的蛋白肽溶液，按表2添加各试剂^[17]。

按表2将各试剂加入到试管中，充分混匀，于暗处反应7 min，在517 nm下测定吸光值。以蒸馏水作为空白对照组。按下列公式计算其清除率：

式中，A₁为复合酶酶解澳洲坚果蛋白酶解液清除DPPH自由基的吸光值;A₀为对照组清除DPPH自由基的吸光值。

1.3数据处理

采用SPSS 17.0软件对试验数据进行分析，结果以平均值±标准偏差来表示，采用Origin 8.0软件对分析后的数据作图。所有试验均设置3次重复。

2  结果与分析

2.1澳洲坚果蛋白酶解工艺优化单因素试验

2.1.1  酶添加比例对澳洲坚果蛋白水解度的影响  通过丝氨酸标准曲线的绘制，得到其标准曲线方程为y=0.0009x+0.1793（x为丝氨酸的含量，单位为μg/mL;y是吸光度，R²=0.9972）。由图1可知，澳洲坚果蛋白水解度随着中性蛋白酶比例的增加而增大，当酶添加比例为1∶4时，澳洲坚果蛋白水解度最大，达到11.95%，而当木瓜蛋白酶比例大于中性蛋白酶时，水解度反而降低，这可能与酶的种类及特异性存在一定的关系。综合各方面因素考虑，复合酶酶解澳洲坚果蛋白的最适酶添加比例（木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶）为1∶4，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为11.95%。

2.1.2  酶解液初始pH对澳洲坚果蛋白水解度的影响  由图2可知，澳洲坚果蛋白水解度在酶解液初始pH为5～8时，随着pH的升高而增大，当pH达到8.0时，其水解度最大，为19.58%。这可能是由于在pH值较低时，澳洲坚果蛋白的溶解度较低，使得酶与底物接触不充分，导致水解度较低;而随着pH升高，澳洲坚果蛋白的溶解度逐渐增大，使得酶可以和底物充分反应，因此澳洲坚果蛋白水解度增加。综合各方面因素考虑，复合酶酶解澳洲坚果蛋白的最适初始pH在8.0左右，在此条件下澳洲坚果蛋白的水解度为19.58%。

2.1.3  酶添加量对澳洲坚果蛋白水解度的影响  由图3可知，随着酶添加量的不断增加，澳洲坚果蛋白的水解度呈逐渐增加的趋势，但水解度的增加幅度逐渐减弱，当酶添加量增加到12 000 U/g时，其水解度达16.62%;继续增加酶添加量，蛋白水解度增加不显著。这可能是因为酶添加量的增加，加大了酶与反应底物的接触面积，使得其反应更加充分，所以水解度会不断增大;而当酶添加量增加到一定程度时，在底物浓度一定的情况下，即使增加酶添加量也不会使得反应的速率增加，到最后会逐渐趋于稳定。综合各方面因素考虑，复合酶酶解澳洲坚果蛋白最适酶添加量为12 000 U/g左右，在此条件下澳洲坚果蛋白水解度为16.62%。

2.1.4  酶解時间对澳洲坚果蛋白水解度的影响  由图4可知，随着复合酶酶解时间的增加，澳洲坚果蛋白酶的水解度不断增大，在360 min时达到最大值，为20.72%，之后便趋于平缓。这可能是因为反应初期，底物含量高，可以充分与酶反应，所以随着时间的不断延长，其水解度逐渐增大;而随着反应的进行，反应产物不断积累，酶的活性受到抑制，导致蛋白水解度趋于平缓。综合各方面因素考虑，复合酶酶解澳洲坚果蛋白最

适酶解时间为360 min左右，在此条件下澳洲坚果蛋白水解度为20.72%。

2.2澳洲坚果蛋白酶解正交试验分析

根据上述单因素实验结果，选择复合酶配比（A）、酶添加量（B）、pH（C）、酶解时间（D）4个因素，每个因素选3个水平。用L₉（3⁴）进行正交优化实验，来确定澳洲坚果蛋白酶解的最佳工艺条件。正交实验设计见表3，结果见表4。