基于函数拟合碘值及脂肪酸成分配制功能性复合油的研究

丁泽人 杨晓君 胡卫成 唐洪松 郑万财

(新疆农业大学食品科学与药学学院1,乌鲁木齐 830052)(淮阴师范学院;江苏省高校区域现代农业与环境保护协同创新中心2，淮安 223300)(内江师范学院经济与管理学院3，内江 641000)

红花籽油具有降低血清中胆固醇含量，防止胆固醇在血管壁沉积，防治动脉粥样硬化及心血管疾病的作用[1-3]。α-亚麻酸(ω-3脂肪酸)仅存在于少量特定的植物籽油中如苏子油、亚麻籽油和核桃油等[4-6]。α-亚麻酸对猴动脉粥样硬化有减轻，促进其消退的作用[7,8]，抑制肝脏胆固醇和NF-kB表达[9]，还有辅助改善记忆能力的作用[10]。LA(ω-6)和ALA(ω-3)在体内的吸收利用具备竞争性，其摄入量和二者比例成为研究热点，临床研究发现ω-6/ω-3比率为4∶1时，则心血管疾病的病死率下降70%[11]；不同比例亚油酸和亚麻酸对鸡原代干细胞增殖的影响的实验结果表明：LA/ALA=10时细胞增殖能力最强[12]；考察ω-6/ω-3脂肪酸平衡对动脉粥样硬化的影响[13]，核桃油、紫苏油以及α-亚麻酸、亚油酸对断奶幼鼠学习记忆的影响及其机制的研究结果证实单纯补充α-亚麻酸、亚油酸不能有效降低实验动物血脂及提高断奶幼鼠的空间学习记忆能力，将植物油脂制备成游离态的多元不饱和脂肪酸混合物后与天然多不饱和脂肪酸三甘酯复配后能增强主要活性物质的功能性和稳定性[14-20]。

课题组前期研究证实将红花籽油(富含顺式亚油酸LA，还含有ALA及其他脂肪酸，三甘酯态)与亚麻籽油提取物(主要成分为游离态的α-亚麻酸ALA，还含有LA及其他脂肪酸)复配制成LA∶ALA满足1∶1～2的红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸脂肪酸复合油具有良好的降血脂效果。将亚麻籽油制备成亚麻籽提取物后，其中的ALA由三甘酯态转变为游离态，使ALA在胃肠道中的吸收率升高，生物活性会升高，代谢转化时相比于三甘酯态的ALA少了脂肪动员水解步骤，能更快进入血液供组织摄取利用；亚麻籽油制备成亚麻籽提取物后，稳定性降低，三甘酯态的红花籽油稳定性好为亚麻籽油提取物中的游离态ALA提供保护，还能调整复合油中的脂肪酸比例，使复合油中LA∶ALA满足1∶1～2这一必须条件[21-24]。然而将多种油脂或脂肪酸复配以使其脂肪酸组成满足一定的比例，目前尚无简便的方法，在实际生产中，需要多次反复实验，多次GC-MS成分分析才能配制出满足要求的产品，又因每批次所用原料的差异,另批生产时又需从原料的脂肪酸组分分析作起；复配周期长，成本高，成为该复合油实际生产应用中的限制性问题，前期研究发现亚麻籽油提取物及红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油中ALA含量与其碘值有相关性[25]；油脂或脂肪酸碘值检测方法的基本原理是利用动植物油脂中不饱和脂肪酸的双键与卤素定量加成；国标GB/T 5532—2008采用的碘剂是 “韦氏试剂”，活性成分为ICl[26]；在依照国标测定碘值，利用GC-MS检测脂肪酸组成含量的前提下，碘值与油脂中尤其是多不饱和脂肪酸复合油中多不饱和脂肪酸的含量或比值存在相关性；基于此，可利用油脂或提取物的实测碘值作为衡量油脂或提取物中已确定的不饱和脂肪酸种类的含量依据，可利用“连续函数求和原理”和“复合函数连续定理”[27]进行拟合制定红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油的碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲。

1 材料与设备

1.1 主要仪器设备

Agilent 7890A-5975C GC-MS，RE-52B旋转蒸发仪，DZTW电热套，PL2002电子天平，XHF-DY高速剪切分散器，PHS-3C型pH计，SF-GL-16A高速冷冻离心机，80-2沉淀离心器。

1.2 主要试剂

红花籽油、亚麻籽油、亚麻籽油提取物、三氟化硼二水合物、环己烷、十二烷基苯磺酸钠、甲醇、氢氧化钠、硫酸、氯化钠、硫酸钠、无水碳酸钠、韦氏试剂、硫代硫酸钠、可溶性淀粉皆为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 亚麻籽油提取物的制备

依照课题组前期皂化中和纯化一体化制备亚麻籽油提取物工艺[28]，先依GB/T 5534—2008测定亚麻籽油的皂化值，作为高速剪切皂化-冷冻分离法制备亚麻籽提取物时皂化过程中加入碱量的依据，制备亚麻籽油提取物时，按皂化值的1.5倍量加入碱进行高速剪切皂化；皂化完毕，在高速剪切条件下加稀硫酸中和后自来水、蒸馏水反复洗涤；取上层清液，不同温度条件反复冷冻-离心分离弃去下层沉淀，得上层清液经无水硫酸钠除水后即为亚麻籽油提取物。

1.3.2 油脂样品碘值的测定

本实验涉及到的油脂样品：亚麻籽油、红花籽油、亚麻籽油提取物、红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油皆依GB/T 5532—2008所规定的方法测定各自的碘值。各样品的碘值测定为后续制定“碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲”提供相应的碘值数据，对依照标曲配制的不同ALA∶LA值红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油碘值测定用于检验标曲是否适用。

1.3.3 亚麻籽油、红花籽油、亚麻籽油提取物的脂肪酸组成GC-MS分析

依GB/T 17376—2008之三氟化硼法对亚麻籽油、红花籽油甲酯化后进行GC-MS检测，分析其脂肪酸组成，为后续制定“碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲”提供相应的脂肪酸组成数据；对依标曲配制的不同ALA∶LA值红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油进行GC-MS检测，分析其脂肪酸组成，检验利用标曲是否能依据测定的碘值准确的配制指定ALA∶LA值的红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油。GC检测条件：色谱柱：HP-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管柱；进样量：0.2 μL；分流比：100∶1；升温程序：起始温度为50 ℃，以10 ℃/min升温至210 ℃，然后以3 ℃/min升温到240 ℃，再以10 ℃/min升到300 ℃/min保持5 min。运行时间：37 min。MS检测条件：电离方式：EI；电离能量：70 eV；离子源发生器温度：230 ℃；质量扫描范围：30～700 amu；溶剂延迟：3 min。

1.3.4 基于函数拟合碘值-脂肪酸组成绘制复合油配制标曲的绘制方法

“连续函数求和原理”和“复合函数连续定理”结合到红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油的“碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲”制备则可表述为：若不同浓度水平红花籽油、亚麻籽油提取物的碘值与其各自LA、ALA含量绘制的相应曲线性度良好，且它们曲线方程形式一致，则由红花籽油和亚麻籽油提取物复配制备的红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油其不同浓度水平的碘值与其LA、ALA含量或比值能拟合绘制线性度良好的相应曲线。由此，能将亚麻籽油提取物与红花籽油不同比例复配，并进行GC-MS检测，获知其ALA∶LA值；同时测定其碘值，以碘值对应ALA∶LA值制定“碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲”，还可以为了表达的简便，用单调函数如对数等将碘值或ALA∶LA比例转换。

1.3.4.1 红花籽油、亚麻籽油提取物脂肪酸组成-碘值曲线绘制方法

本研究对47例老年肺炎患者及20例健康老人的血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平进行了检测和比较，结果显示老年肺炎患者血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平明显高于对照组(P＜0.05)，可能是因为发生肺炎等肺部疾病时，患者机体存在的炎症反应会激活机体应急反应及凝血系统，最终表现为上述3个指标的升高，本研究还发现高危组老年肺炎患者血清PCT、CRP及D-Dimer水平明显高于中危及低危2组患者，且其升高水平与肺炎严重程度呈正相关，随着患者病情越重，其浓度越高。

依据“连续函数求和原理”和“复合函数连续定理”，先对红花籽油、亚麻籽油提取物的脂肪酸组成进行GC-MS分析，明确两者脂肪酸组成，再将两种配制原料以环己烷稀释成不同浓度，取同体积，分别测定其碘值，绘制各自脂肪酸组成-碘值曲线，看两种复合油配制原料的碘值是否与其脂肪酸组成变化成线性关系，判断连续性和单调性。

故精确称取红花籽油、亚麻籽油提取物，分别以色谱纯环己烷为稀释剂配制浓度(w/w)为0、20%、40%、60%、80%、100%的系列溶液，恒定其质量为100 g，依照GB/T 5532—2008 动植物油脂碘值的测定”规定的碘值检测方法进行碘值测定；先依照红花籽油、亚麻籽油提取物的GC-MS检测结果计算不同浓度溶液中ALA和LA的含量(mol)；再将两者不同浓度环己烷溶液中所含ALA、LA的量分别与不同浓度红花籽油、亚麻籽油提取物环己烷溶液碘值均值拟合绘制曲线；分别求证红花籽油、亚麻籽油提取物中特定的ALA、LA脂肪酸组分含量的变化是否与红花籽油、亚麻籽油提取物的碘值呈线性关系。

1.3.4.2 复合油的碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲绘制方法

依“复合函数连续定理”和“复合函数连续定理”若两种复合油的配制原料与其脂肪酸组成变化成线性关系，则将亚麻籽油提取物与红花籽油不同比例复配，并进行GC-MS检测，获知其ALA∶LA值；同时测定其碘值，以碘值对应ALA∶LA值制定“碘值-脂肪酸组成及比例复配标曲”。

故以红花籽油、亚麻籽提取物为原料配制系列红花籽油加入量不同的复合油，依照前述脂肪酸组成GC-MS检测方法对系列红花籽油加入量不同的复合油进行脂肪酸组成分析，获知其中LA、ALA的含量，计算系列复合油中LA∶ALA的值(w/w)；测定系列复合油的实际碘值，将配制复合油的红花籽油加入比例(wt%)与复合油的实际碘值拟合绘制红花籽油占比-复合油碘值复配标曲；将复合油中LA/ALA值倒数与复合油碘值的对数值(lgI2)拟合绘制LA/ALA值倒数-碘值对数值复配标曲；在红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油配制时可根据红花籽油占比-复合油碘值复配标曲可以计获知配制的复合油的碘值，由碘值可根据LA/ALA值倒数-碘值对数值复配标曲获知复合油中LA/ALA值。

1.3.5 碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲的检验

3 结果

3.1 亚麻籽油提取物的制备

依照2.1所确定的方法，取100 g亚麻籽油经高速剪切皂化后中和洗涤，再经不同温度条件下反复离心分离得到亚麻籽油提取物71.4 g，-20 ℃条件下冷冻避光保存备用。

3.2 亚麻籽油、红花籽油、亚麻籽油提取物的碘值

依照GB/T 5532—2008规定的方法测定原料亚麻籽油、红花籽油、亚麻籽油提取物的碘值见表1。

表1 亚麻籽油提取物、亚麻籽油、红花籽油的碘值(gI/100 g)

3.3 亚麻籽油、红花籽油、亚麻籽油提取物的脂肪酸组成

依照2.3的GC-MS检测条件对亚麻籽油、亚麻籽油提取物、红花籽油、脂肪酸组成进行分析，利用Famedb 23.L和NIST14.L两数据库交叉检索对比，各油样中GC-MS检测数据与库中数据符合置信度大于95%时，认为该油样含有该物质，各组分的峰面积、百分含量由Lscint.p化学工作站积分器积分计算。各油样中物质保留时间、峰面积、脂肪酸含量、匹配度等情况分别见表2～表4。

表2 亚麻籽油的GC-MS检测结果

表4 红花籽油的GC-MS检测结果

3.4 基于函数拟合碘值-脂肪酸组成绘制复合油配制标曲

3.4.1 红花籽油脂肪酸组成-碘值曲线

依照表4红花籽油的GC-MS检测结果计算不同浓度溶液中ALA和LA的含量；将不同浓度红花籽油环己烷溶液中所含ALA、LA的量(mol)分别与不同浓度红花籽油环己烷溶液碘值均值拟合绘制曲线，不同红花籽油浓度中LA的含量与其实测碘值拟合曲线的方程为：Y=592.84X+8.318 3，R=0.996 0，线性度良好；不同红花籽油浓度中ALA的含量与其实测碘值拟合曲线的方程为：Y=1 272X+8.298 2，r=0.996 0，线性度良好。

3.4.2 亚麻籽油提取物组成-碘值曲线

依照表3亚麻籽油提取物GC-MS检测结果，同3.4.1操作，将亚麻籽油提取物中ALA、LA脂肪酸组分含量的变化与亚麻籽油提取物的碘值拟合，不同亚麻籽油提取物浓度中LA的含量与其实测碘值拟合曲线的方程为：Y=2 667.5X+7.893 3，r=0.998 1，线性度良好；不同亚麻籽油提取物浓度中ALA的含量与其碘值拟合曲线的方程为：Y=790.46X+7.820 5，r=0.998 0，线性度良好。

表3 亚麻籽油提取物的GC-MS检测结果

不同浓度红花籽油、亚麻籽油提取物中LA、ALA含量与其碘值拟合曲线线性度良好，且两者LA、ALA含量与各自的碘值拟合曲线线性度接近，在两者不同浓度环己烷溶液中LA、ALA的含量与其各自的碘值拟合所得曲线的方程形式一样；证明尽管油的种类及脂肪酸状态(三甘酯态和游离态)不同，但LA和ALA的组成含量-碘值曲线存在可拟合性。由此，若将红花籽油与亚麻籽油提取物按照不同比例复配，则制备成的红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油中LA、ALA含量与复合油碘值可拟合成一条线性度良好的曲线。

3.4.3 基于函数拟合绘制的碘值-脂肪酸复配标曲

红花籽油占比-复合油碘值复配标曲见图1，复合油LA/ALA值倒数-碘值对数值复配标曲见图2。

图1 红花籽油占比-复合油碘值复配标曲

图2 复合油LA/ALA值倒数-碘值对数值复配标曲

红花籽油占比-复合油碘值复配标曲的方程为：Y=-38.143X+180.24，r=0.985 4，线性度良好，复合油LA/ALA值倒数-碘值对数值复配标曲的方程为：Y=0.021 5X+2.188 3,r=0.973 3，线性度良好。

3.5 碘值-脂肪酸组成及(ALA∶LA)比例复配标曲的检验结果

若依照图1、图2所绘制的标曲，另取60%的红花籽油与40%的亚麻籽油提取物复配时，LA∶ALA=1.837即可配制成满足具备良好降血脂功能的红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油(LA∶ALA=1～2)，此时该复合油的碘值应为159.45。为验证该标曲的准确性，将60%的红花籽油与40%的亚麻籽油提取物复配利用GC-MS对其脂肪酸组成进行分析，并测量其碘值，考察其脂肪酸组成和碘值是否与标曲指示的一致，测定的碘值为159.70；GC-MS检测结果的交叉对比检索库、置信度取舍、化学积分工作站等同2.3.2，其GC-MS总离子图见图3，其中所含各脂肪酸组分的各物质保留时间、峰面积、脂肪酸含量、匹配度等情况见表5。

图3 新配60%红花油与40%亚麻籽油提取物复合油的GC-MS总离子图

表5 新配60%红花油与40%亚麻籽油提取物复合油的脂肪酸组成GC-MS检测结果

由表5可知，经GC-MS脂肪酸组分检测，依照标曲配制的复合油中顺式亚油酸(LA)的含量为45.3%，α-亚麻酸(ALA)的含量为24.24%，LA∶ALA=1.87，满足课题实验复合油中LA ∶ALA=1～2的要求且复合油中LA与ALA实际比值(LA∶ALA=1.87)与标曲中显示的比值(LA∶ALA=1.83)接近一致。

若依照图1、图2所绘制标曲，将70%的红花籽油与30%的亚麻籽油提取物复配制得的复合油，依照标曲，其碘值应为153.53，则其中LA：ALA=2.69；对该复合油进行GC-MS脂肪酸组成分析，其总离子流图见图4，脂肪酸组成分析结果见表6。

图4 新配70%红花油与30%亚麻籽油提取物复合油的GC-MS总离子图

表6 新配70%红花籽油与30%复合油的脂肪酸组成GC-MS检测结果

由表6可知，经GC-MS脂肪酸组分检测，依照标曲配制的70%红花籽油与30%亚麻籽油提取物复合油中顺式亚油酸(LA)的含量为59.70%，α-亚麻酸(ALA)的含量为21.09%，LA∶ALA =2.831，实测碘值为154.6；复合油中LA与ALA实际比值(LA∶ALA=2.83)与标曲中显示的比值(LA∶ALA =2.690)接近一致，标曲碘值与实测碘值接近一致。

3.6 讨论

本研究分别将红花籽油、亚麻籽油提取物中LA、ALA组成含量与其各自的碘值拟合绘制曲线，考察各拟合曲线的方程形式和线性度以及单调性，看是否复合数学“连续函数求和原理”和“复合函数连续定理”；证实将红花籽油与亚麻籽油提取物复配制备成红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油后，复合油中的LA、ALA的含量以及LA与ALA的比值依然与复合油的碘值可拟合，为了表达的简便，用单调对数函数和倒数将碘值和ALA:LA比例转换，由此制定出红花籽油占比-复合油碘值复配标曲、LA/ALA值倒数-碘值对数值复配标曲，可以基于测量的碘值快速配制ALA∶LA比例明确的红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油，缩短了配制实验周期，简化了配制过程中的检测手段，降低配制实验成本。

在实际应用中可先明确拟进行复配的几种油脂原料的脂肪酸组成，计算油脂中主要不饱和脂肪酸的含量，以不同比例的油脂原料复配制备系列复合油；依照脂肪酸组成检测数据计算系列复合油中不饱和脂肪酸的含量；依照GB/T 5532—2008规定的碘值检测方法进行复合油碘值测定；将复合油碘值与复合油中不饱和脂肪酸含量或多种不饱和脂肪酸含量比值拟合绘制相应的不同形式的“碘值-脂肪酸组成复配标曲”。若需要制备复合油的油脂原料中都不含有不饱和脂肪酸，则复配前和复配后的碘值接近，即不能依照“碘值-脂肪酸组成复配标曲”绘制方法制备相应的复配标曲；若制备复合油的油脂原料中有一种原料含有不饱和脂肪酸，不含有双键的饱和脂肪酸相当于不饱和脂肪酸的溶剂，依然可利用本研究确立的“碘值-脂肪酸组成复配标曲”绘制方法制备相应的复配曲线。

4 结论

本研究基于“连续函数求和原理”和“复合函数连续定理”拟合GC-MS脂肪酸组分分析和碘值，制定出了“红花籽油占比-复合油碘值复配标曲”(Y=-38.143X+180.24，r=0.985 4)及复合油LA/ALA值倒数-碘值对数值复配标曲(Y=0.021 5X+2.188 3，r=0.973 3)，对依照标曲复配的不同LA/ALA值红花籽亚麻籽多不饱和脂肪酸复合油进行GC-MS脂肪酸组分分析验证，证实标曲可用。这种通过函数拟合碘值与脂肪酸组成或比例变化，绘制相应复配标曲的方法对实际生产要求配制某些脂肪酸组分比例明确的复合油有一定的借鉴意义。