超高效液相色谱串联质谱法测定血浆中烷基间苯二酚

张雪松 王宇飞 王国栋 向雪松 王竹

摘要：目的：建立超高效液相色谱串联质谱法测定血浆中2种全麦食品生物标志物烷基间苯二酚（ARs）的方法。方法：血浆加入内标，经丙酮提取，离心取上清液过滤，滤液吹干异丙醇定容，使用实心核色谱柱（21mm×100mm，16μm）为分离柱，以异丙醇∶乙腈=30∶70为流动相，等度洗脱，质谱采用电喷雾负离子模式，多反应监测模式进行检测，用内标法定量。结果：2种ARs在2～200ng/mL浓度范围内线性良好，r2>0998 0。方法检出限为01ng/mL，定量限为03ng/mL，加标回收率为882%～110%，相对标准偏差为248%～132%（n=6）。结论：该方法快速准确、灵敏度高、前处理简单，能够有效测定血浆中2种ARs的含量。

关键词：烷基间苯二酚;全麦食品;血浆;超高效液相色谱串联质谱

烷基间苯二酚（Alkylresorcinols，ARs）是weIlkert等[1]首次于小麦、黑麦等麦类中发现，特异地存在于小麦、黑麦等麦类的麸皮中，而胚和胚乳中不含有ARs。麦类麸皮中的ARs的烷基侧链一般为含有15～25个奇数碳原子的饱和碳链，分别为5十五烷基间苯二酚（AR C15∶0）、5十七烷基间苯二酚（AR C17∶0）、5十九烷基间苯二酚（AR C19∶0）、5二十一烷基间苯二酚（AR C21∶0）、5二十三烷基间苯二酚（AR C23∶0）、5二十五烷基间苯二酚（AR C25∶0），其中主要以AR C19∶0与AR C21∶0为主[2]。麦类麸皮中的ARs被人体摄入后，可在血浆等生物样本中检测到其同系物或代谢物，当人们进食无麸皮的膳食时，则不能检出，因此可以作为全麦产品摄入的生物标志物[34]。最初对于血浆AR的测定方法主要是气相串联质谱法[5]，但是ARs需要进行化学衍生化为可挥发成分再进行测定，前处理过程繁琐，无法快速地检测大量样品，一定程度上限制了ARs作为生物标志物在流行病学研究中的应用。随后逐渐采用液相串联质谱法，但是该方法需采用正相色谱，适用范围窄，同时也需要进行固相萃取，且检测过程ARs回收率较低[67]。而目前我国还未有血浆中ARs检测方法的报道，因此，本研究针对麸皮中含量较高的AR C19∶0与AR C21∶0，应用反相超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）建立一种快速简便的方法测定血浆中的ARs，以便于ARs作为摄入全麦的生物标志物的推广应用。

1材料与方法

11样品

大鼠血浆：雄性SD大鼠，体重约200g，正常饮食，禁食过夜后取空腹血液，以3 000r/min离心10min后取上层血浆，分装于冻存管中，样品置于-80℃冰箱冷冻保存，避免反复冻融。

人血浆：遵循赫尔辛基宣言的伦理学指导方针，招募男性健康无全谷物饮食习惯志愿者，本实验需进行2次血浆采集，第一次是空白血浆采集，由专业人员采集空腹血2mL。第二次是提供给志愿者晚餐全麦馒头（ARs含量约为39mg/个），志愿者自愿进食，晚餐后禁食，次日由专业人员抽取空腹血2mL。空腹血经3 000 r/min离心10min后，提取上层血浆，置于冻存管中，于-80℃冰箱冷冻保存。

12仪器与设备

超高效液相色谱串联质谱仪Waters Xevo，TQS，Waters公司;离心机Eppendorf 5418，Eppendorf公司;精密电子天平PB602N，MettlerToledo公司;涡旋混合仪GENIUS3，Ika公司;超纯水系统MilliQ Advantage A10，Millipore公司;-80℃医用低温保存箱DW86L626，海尔公司;CORTECS UPLC C18 色谱柱（粒径16μm、内径21mm、长度100mm），Waters公司;CORTECS UPLC C18 保护柱（粒径16μm、内径21mm、长度5mm），Waters公司。

13试剂

5十九烷基间苯二酚（AR C19∶0，95%，Sigma公司）、5二十烷基间苯二酚（AR C20∶0，95%，Sigma公司）、5二十一烷基间苯二酚（AR C21∶0，95%，Sigma公司）、甲醇（色谱纯，Fisher公司）、乙腈（色谱纯，Fisher公司）、丙酮（色谱纯，Fisher公司）、异丙醇（色谱纯，Fisher公司）、乙醇（色谱纯，Fisher公司）、乙醚（分析纯，北京化工厂）、乙酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）、水为 GB/T 6682 规定的一级水。

14实验方法

141標准溶液的配制取1mg AR C19∶0、AR C21∶0的标准品，用甲醇定容至100mL，制成10μg/mL的混合标准储备液，-20℃保存。称取1mg AR C20∶0标准品，用甲醇定容至100mL，制成10μg/mL内标溶液，-20℃保存。使用前将混合标准储备液逐级稀释，配制成2、4、8、10、20、40、80、100、200ng/mL的标准工作液，内标AR C20∶0浓度为100ng/mL。

142超高效液相色谱条件色谱柱：Waters CORTES UPLC C18色谱柱（内径21mm、柱长100mm、粒径16μm）;流动相：乙腈∶异丙醇=70∶30，等度洗脱;柱温30℃;进样量2μL;流速03mL/min。

143质谱条件采用电喷雾负离子模式（ESI）电离;多反应监测模式（MRM）进行定性定量分析;锥孔电压30V;锥孔气流量150L/h;离子源温度 150℃;脱溶剂气温度500℃;AR C19∶0、AR C20∶0、AR C21∶0特征离子及相关质谱参数见表1。

144样品处理取100μL血浆加入50μL AR C20∶0标准溶液（100ng/mL）后，加入850μL丙酮涡旋振荡2min，在10 000r/min的转速下离心10min后，取上清溶液过022μm滤膜，取500μL滤液在25℃氮气吹干，加入50μL异丙醇复溶，混合均匀后，在10 000r/min转速下离心1min取上清检测。

15统计方法

采用Excel 2013进行数据录入编辑，以SAS 94进行统计分析，组间比较采用oneway ANOVA方差分析，以P<005 为差异有统计学意义。

2结果与分析

21提取溶剂的选择

以大鼠血浆为样品，比较乙醚、丙酮等提取溶剂的提取效果。具体方法：（1）乙醚提取，取100μL大鼠血浆加入50μL AR C20∶0标准溶液（100ng/mL），加入05mL乙醇、05mL水和3mL含有60μL乙酸的乙醚，涡旋振荡2min，以-40℃冰乙醇冷冻水相，取上层有机相，乙醚重复萃取3次，有机相合并后过022μm滤膜，滤液氮气吹干，50μL甲醇复溶，涡旋混匀后上机检测。（2）丙酮提取甲醇复溶，取100μL血浆加入50μL AR C20∶0标准溶液（100ng/mL）后，加入850μL丙酮涡旋振荡2min，在10 000r/min的转速下离心10min后，取上清溶液过022μm滤膜，取500μL滤液在25℃氮气吹干，加入50μL甲醇复溶，混合均匀后，再以10 000 r/min转速离心1min后取上清检测。（3）丙酮提取异丙醇定复溶，滤液氮气吹干后加入50μL异丙醇复溶，其余与方法2步骤一致。由表2可知，方法1 AR C19∶0和AR C20∶0均未检出，方法2与方法3结果无显著性差异，但方法3精密度较好（RSD%<10%），选择方法3作为样品的提取方法。

22色谱条件的确定

ARs属于弱极性物质，并且随着烷基侧链长度的增加极性逐渐减弱，以往研究多采用正相色谱体系分离ARs，适用范围窄，在本项目前期测定全麦样品中ARs方法的基础上，采用异丙醇∶乙腈=30∶70为流动相，并因异丙醇粘度较大，选择背压较低的实心核色谱柱（Waters CORTES UPLC C18），3种ARs可以在5min内得到良好的分离。

23质谱检测条件的确定

通过比较全扫描模式下的手动优化和仪器自动优化结果，采用电喷雾负离子模式（ESI），并确定了AR C19∶0、AR C21∶0、AR C20∶0的质谱检测条件。采用表1中的质谱条件对AR C19∶0、AR C20∶0、AR C21∶0进行定性分析（附图）。

24标准曲线、检出限及定量限

标准系列工作液经022μm滤膜过滤后分别注入液相色谱质谱仪中，测定相应的AR C19∶0、AR C21∶0峰面积，以标准系列工作液中的AR C19∶0、AR C21∶0濃度为横坐标，以AR C19∶0、AR C21∶0的响应值与内标AR C20∶0的响应值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。向空白人血浆中加入AR C19∶0与AR C21∶0标准品，以信噪比 S/N=3时对应的浓度为方法检出限;以信噪比 S /N=10时对应的浓度为方法定量限。表3可见，AR C19∶0与AR C21∶0在2～200ng/mL浓度范围内线性良好，且方法灵敏度高。

25方法精密度、准确度

取已知本底值的大鼠血浆和人血浆，分别添加3个浓度水平的标准溶液，每个水平平行测定6次，以加标回收率评价方法的准确度，以相对标准偏差评价方法的精密度。表4～5可见，加标回收率在882%～115%之间、相对标准偏差<132%（n=6）。

3结论

本研究采用超高效液相色谱串联质谱建立了血浆中AR C19∶0、AR C21∶0的测定方法。该方法前处理简单，灵敏度高，精密度、准确度良好，能够达到血浆中AR C19∶0、AR C21∶0定性定量的要求。但要明确全麦食品中ARs的摄入量与血浆中ARs含量的关系，还需要进一步的实验研究。◇

参考文献

[1]Kozubek A，Tyman JHPResorcinolic lipids，the natural nonisoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity[J].Chem Rev，1999，30（12）：126

[2]王宇飞，张雪松，向雪松，等全麦中烷基间苯二酚液相荧光测定方法的建立[J].营养学报，2018，40（4）：392397

[3]Ross AB，Shepherd MJ，Schupphaus M，et al Alkylresorcinols in cereals and cereal products[J].J Agric Food Chem，2003，51（14）：41114118

[4]Kyro C，Olsen A，Landberg R，et alPlasma alkylresorcinols，biomarkers of wholegrain wheat and rye intake，and incidence of colorectal cancer[J].J Natl Cancer Inst，2014，106（1）：352

[5]Linko AM，Parikka K，Wahala K，et alGas chromatographicmass spectrometric method for the determination of alkylresorcinols in human plasma[J].Anal Bioch，2002，308（2）：307313

[6]Ross AB，Svelander C，Savolainen OI，et alA high throughput method for LCMS/MS determination of plasma alkylresorcinols，biomarkers of whole grain wheat and rye intake[J].Anal Bioch，2016（499）：17

[7]Ross AB，Redeuil K，Vigo M，et alQuantification of alkylresorcinols in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2010，24（5）：554560