链格孢霉菌毒素的研究进展*

郭诗曼，冯 启

(浙江外国语学院科学技术学院，浙江 杭州 310023)

链格孢霉菌(Alternariatoxins) 是一种丝状真菌，在蔬菜、水果及谷物中的病原体和腐生菌中多有发现[1]。经研究发现，这些代谢产物具有致突变、致癌、致畸、致死、细胞毒性、基因毒性、胚胎毒性、急性毒性等毒性[2]，比如研究人员发现了某些代谢物与人类食道癌密切相关[3]。农作物被该菌侵染之后会出现小麦黑斑病、柑橘黑斑病等常见的病害，造成粮食减产或水果腐烂。链格孢霉菌的污染地域也十分广阔，遍及欧洲、美洲及亚洲。欧洲食品安全局已经对链格孢霉毒素进行了风险评估，认为具有遗传毒性的交链孢酚与交链孢酚单甲醚应该引起人们的重视[4]。而此前，该菌都未引起学者的关注，考虑其污染范围、污染物种及毒理性质，目前已经有越来越多的科学家着手研究链格孢霉毒素。但是目前全世界范围内都没有定制链格孢霉菌毒素的限量标准。本文详细综述了链格孢霉菌毒素的毒理性质与污染现状，概述了检测方法，旨在推动我国尽快建立关于链格孢霉菌毒素的标准与规范。

1 简介与毒理性质

链格孢霉菌是一种广泛分布于泥土的真菌，能通过田间侵染、贮存接触等途径污染农作物。值得注意的是，由于链格孢霉菌能在低温环境下完成生长繁殖，所以链格孢霉菌还是导致瓜果、蔬菜以及一些冷藏食品腐败变质主要真菌。链格孢霉菌能产生许多次级代谢产物，其中有一些已被证实具有明显毒性[5]，但是只有很少一部分毒素的化学结构被表征，这些毒素根据其化学结构可分为五类(见表1和图1)。其中，AOH、AME、TeA、TEN是目前科学家们关注最多的四种毒素。

表1 链格孢霉毒素分类

1.1 交链孢酚(AOH)

AOH的外观为无色针状晶体，分子式为C14H10O5，摩尔质量为258.23，熔点350 ℃，密度1.56 g/cm3，与氯化物混合反应后会呈现紫色，经紫外线照射后会发出蓝色荧光[6]。目前发现AOH 具有致突变性、致癌性、基因毒性、遗传毒性、细胞毒性、胚胎毒性，但AOH对实验所用动物的急性毒性较低。

Celia等[7]评估了AOH引发毒性的途径，结果显示经AOH处理24 h和48 h后的细胞出现凋亡或坏死，线粒体膜电位(Δψm)也出现相应变化，从而产生细胞毒性。Fernández等[8]也评估了AOH在人结肠腺癌(Caco-2)细胞中的细胞毒性，结果表明，AOH在最高测试浓度下对Caco-2细胞具有细胞毒性作用。Liu等[9]研究发现AOH可引起细胞的致突变和转化，还可诱导胎儿食管鳞状细胞癌的发生。此外，有研究显示AOH与我国某些地区食管癌高发密切相关[4]，且AOH的致癌机理与AOH的活性、癌基因的激活以及抑癌基因的变异密切相关。

Fliszár-Nyúl等[10]对AOH与牛、猪和大鼠蛋白的结合亲和力进行了测试，结果表明AOH与血清蛋白有很强的相互作用，提示了这些相互作用在体内的潜在重要性。还有研究发现，AOH通过抑制DNA拓扑异构酶的活性来诱导细胞死亡。拓扑异构酶与DNA的超螺旋调节联系在一起，并参与细胞的复制、转录和修复等，AOH由此引起单链 DNA 和双链 DNA 的断裂[11]。Solhaug等[12]发现细胞应激通常与自噬有关，因此采用RAW264.7巨噬细胞模型来验证AOH诱导自噬的假说。透射电镜分析表明，AOH处理的细胞不仅能清晰地显示自噬相关的结构，如自噬体和自体溶酶体，而且还能清晰地显示板层小体的出现。长期的AOH处理使细胞形态由圆形变为星形，β-半乳糖苷酶活性增加，这表明细胞最终进入衰老。因此，这些数据表明AOH是自噬和衰老的诱导剂。且这些作用可能与AOH诱导的DSB(通过对拓扑异构酶活性的影响)有关，导致p53和Sestrin2-AMPK-mTOR-S6K信号通路的激活。

图1 四种链格孢霉毒素化学结构示意图

此外，有研究发现AOH 对细胞天然免疫具有调节作用，Grover等[13]研究了AOH对人支气管上皮细胞株(Beas-2B)和小鼠巨噬细胞株(RAW 264.7)天然免疫的调节作用，在研究中发现AOH能抑制脂多糖(LPS)诱导的天然免疫反应。用AOH处理Beas-2B细胞会引起形态学改变，包括分离的生长模式和伸长的手臂。AOH相关免疫抑制和形态学改变与这些真菌毒素在G2/M期引起细胞周期阻滞的能力有关。

1.2 交链孢酚单甲醚(AME)

AME的许多性质都与AOH相似，如外观都是无色针状晶体，经紫外线照射都可发出蓝色荧光。AME的分子式是C15H12O5，摩尔质量为272.25，熔点 267 ℃。AME具有致畸性、致突变性、致癌性、胚胎毒性、诱变性。

有学者对AME的诱变性进行研究，如An等[14]研究发现，AME是大肠杆菌ND-160菌株的一种强诱变剂，而AME的致突变性表现出对特定基因组区域或DNA序列的选择性。研究还发现，经高剂量AME喂养后的胎鼠会出现不同的症状，例如平均体重减轻和严重的器官衰竭。AME还可能引起细胞周期变化，例如动脉内出血，从而诱导癌细胞的产生。石智勇等[15]对食管癌高发区粮食中分离的AME在大鼠、小鼠体内的分布进行研究。实验结果表明AME对前胃、食管下半部分有较高的亲和力。

AME与其他毒素之间存在协同作用。Bensassi等[16]研究了交替醇二元混合物(AOH和AME)对人肠细胞株HCT 116细胞的作用。发现将HCT 116细胞暴露于低剂量的AOH或AME时，会产生细胞毒性，然而，当二者加在一起时，它们的毒性潜力就会大大增加。因此，该研究表明，AOH与AME的结合具有明显的相加性。

1.3 细交链孢菌酮酸(TeA)

TeA是一种油状、褐色物质，易溶于多种有机溶剂，能与许多物质发生螯合[17]。作为美国食品和药物管理局(FDA)在有毒化学物质注册中列出的唯一链格孢属毒素，该毒素的特征是检出率低，但产生毒素的能力非常强[2]。TeA具有急性及亚急性毒性、胚胎毒性、细胞毒性、致癌性以及致死性。

Yekeler等[18]研究了TeA对小鼠食管的可能毒性作用。小鼠口服TeA 10个月后，光镜观察发现这些动物出现以极性丧失、核多形性和色素亢进为特征的发育不良。经TeA处理的粘膜上皮细胞电镜观察显示，部分细胞核固缩、颗粒化、染色质增多、核轮廓不规则、核质空泡化，在原子核中有明显的多形性。综上所述，Yekeler等认为TeA具有较高的毒性，表现为转化异常。Gregory等[19]研究了AOH、AME、ALT、TeA对鸡胚的影响。采用卵黄囊注射方法，对7日龄鸡胚分别注射1000、500和1000 μg剂量的AOH、AME和ALT时，没有出现致死率或致畸作用。而对鸡胚注射548 μg剂量的TeA时，就有50%鸡胚出现死亡，证实了TeA有致死性。除上文提到的毒性外，还有研究发现TeA可作为一些抑制剂。如Zhou等[20]发现TeA是防治棉花和烟田等重要双子叶草和单子叶杂草的一种生物除草剂。

1.4 腾毒素(TEN)

TEN表现为结晶状，在有机溶剂中极易溶解，熔点为172～175 ℃[21]。TEN是环四肽类毒素，具有植物毒性，与植物萎黄病密切相关，能通过降低植物细胞内ATP酶活性来抑制光合磷酸化。值得注意的是，TEN对哺乳动物的毒性试验目前尚未见报道。

1.5 毒理学评估

2011年，欧洲食品安全局(EFSA)应欧盟的请求，审查食品和饲料中链格孢霉毒素的安全性。经研究，EFSA发现这些毒素一般存在于谷物和谷物制品、番茄和番茄制品、葵花籽和向日葵油、水果和水果制品以及啤酒和葡萄酒中。且链格孢霉毒素不仅能对许多作物造成植物疾病，其中一些毒素还能在体外和/或在大鼠体内产生遗传毒性[4]。因此，EFSA采用了毒性关注阈值(TTC)方法来评估人类饮食中接触这些毒素的相对关注程度。对于遗传毒性毒素AOH和AME，目前人们慢性饮食接触量已超过了相关的TTC值，需要引起人们的关注。而非遗传毒性的TeA和TEN的饮食接触估计值低于相关的TTC值，被认为不太可能成为人类健康的问题。同时，EFSA也对其摄入量发表了科学意见，TEN最大日摄入量阈值初步设为1500 ng/kg bw/d。我国国家风险评估中心也对链格孢霉毒素进行了评估，结果表明：随膳食摄入的TeA对2～6岁儿童会存在健康威胁。然而，目前除巴伐利亚外，世界各地均无关于链格孢霉菌毒素的法规，我国只在出口水果蔬菜中链格孢菌毒素的测定中规定了其检出限为10 μg/kg。考虑其毒性、污染范围、污染地域，笔者认为我国应尽快建立关于链格孢霉毒素的标准与法规。

2 污染现状

2.1 瓜果蔬菜

大多数果蔬营养丰富、含水量高，故极易于被链格孢霉毒素感染而得病。2000年以来，全球各地均有番茄、苹果、蓝莓、葡萄、柑橘等瓜果经报道被AOH与AME感染。而在上述提到的这些瓜果蔬菜中，最易受链格孢霉毒素感染的是番茄及其制品等，且TeA检出率最高，其次是AOH和AME。

Noser等[22]研究了瑞士市场中的85种番茄产品，包括去皮和切碎的西红柿，番茄汤和番茄酱以及干的和新鲜的西红柿，发现有7份样品中检出了TeA。Sanzani等[23]对意大利南部的鲜、干番茄中交链孢毒素含量进行检测，结果表明所有番茄样品均不同程度地受到TeA的污染，其次是AME、TEN和AOH。除上述国家外，美国、巴西、阿根廷、瑞士、意大利等地的番茄中均有交链孢霉毒素检出。

除番茄外，橘类也非常容易被链格孢霉菌感染。史文景等[24]采用UPLC-ESI-MS-MS法测定了100个柑橘样品中的链格孢霉毒素，结果显示有15%柑橘果皮样品呈阳性，7%份全果样品呈阳性，同时有3份果肉样品被检测出AME。

2.2 谷物及其制品

链格孢霉菌是普遍存在于各种谷物中的主要致病真菌。与果蔬相比，寄生于谷物中的链格孢菌株种类比较少，但其分布非常广，遍及全球各地，德国和阿根廷等国家还曾爆发过由链格孢霉毒素引起的小麦黑胚病，导致小麦急剧减产，损失惨重，为此，欧洲长期监测链格孢霉菌对小麦的危害。

Jovana等[25]首次评价了链格孢霉菌侵染及其毒素对小麦品质的影响。结果表明，真菌污染显著降低了贸易和工艺质量参数。接种链格孢霉菌后的小麦体积重、千粒重和湿面筋含量显著降低，蛋白质含量显著提高。AOH对体积重和千粒重影响最大(-0.847；-0.898)，与蛋白质含量(0.758)呈极显著正相关。链格孢霉菌另外还破坏了面粉面筋结构，导致面团能量降低和烘焙质量下降。

Marina等[26]研究2001年至2010年勃兰登堡州(德国)不同地区商业农场的1064个新收获的冬小麦样本中的链格孢霉毒素含量。采用二极管阵列和荧光检测器相结合的高效液相色谱法(HPLC)分析了AOH、AME、ALT和TeA。最常见的真菌毒素是TeA，1064份样品中有322份(30.3%)受TeA污染，86份(8.1%)被AOH污染，33份(3.1%)被AME污染，267份(2.6%)样品中有7份(2.6%)受ALT污染。所有年份的最高毒素含量分别为4224 μg(TeA)kg-1，832 μg(AOH)kg-1，905 μg(AME)kg-1和197 μg(ALT)kg-1。几种真菌毒素在小麦样品中的共现率较低：只有3份样品被全部4种毒素污染，14份被3种毒素污染，61份被2种毒素污染，273份被一种毒素污染。

2.3 油料作物

油料作物是一种种子中含有大量脂肪的作物，可用于提取食用油或用作工业和医学原料。油料作物及其产品(例如食用油)非常容易受到霉菌毒素的污染。根据联合国粮食及农业组织的估计，每年全球约25%的农产品被霉菌毒素污染，而油料作物无论是通过淋滤还是压榨，其中的霉菌毒素都会随之迁移到成品油中。Kralova等[27]2002-2003年共分析了在有机和/或常规耕作条件下种植的122个亚麻和84个豌豆种子样本。结果显示，有20份亚麻籽中检出AME，其中2份和4份种还分别检出ALT(交链孢烯)和AOH。Hickert等[28]对来自南非不同产地的不同品种的向日葵种子样品(N=80)中链格孢属真菌产生的15种毒素进行了分析。结果显示，超过80%的样品对一种或多种的链格孢霉毒素检测结果呈阳性，并且其中TEN的检出率最高，为73%，其次是TeA，检出率为51%。

3 检测方法

3.1 高效液相色谱法

HPLC常用于真菌毒素的实验室仲裁检测。Andersen等[29]建立了一种利用HPLC检测和定量检测苹果致病性和产毒链格孢霉菌的实时PCR方法。实验对8株链格孢霉菌进行了AM-毒素I基因及其产物的分析。结果表明，8株菌株均含有AM毒素基因，均能产生植物致病性触须毒素。Pavón 等[30]采用HPLC对样品中α-烯、互变酚和互变酚甲醚的发生情况进行了分析，以评价PCR法鉴定含有链格孢霉毒素的番茄样品的能力。PCR检测表明有链格孢霉菌的存在，90份商品样品中有41份(45.6%) DNA，而在31份PCR阳性样品中，HPLC检测到至少1份链霉菌毒素。链格孢霉菌DNA的检测与所分析的链格孢霉毒素的存在有很好的相关性。

3.2 高效液相色谱-串联质谱法

高效液相色谱-串联质谱法是目前链格孢霉毒素最常用的测定方法。Lilly等[31]建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法，并应用稳定同位素稀释法进行了分析。方法检出限(LOD)为0.86 g/kg，定量限(LOQ)为2.89 g/kg。共对德国市场的26个番茄样品和4个铃椒样品进行了分析。每个样品中均检出TeA，其浓度范围为2330 μg/kg～3 g/kg。Sebastian等[32]建立了稳定同位素稀释HPLC-MS/MS方法，对德国市场上的20种番茄产品进行了色谱分离，结果显示所有产品均被TeA污染。Fraeyman等[33]建立了一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定猪和肉鸡血浆中TeA含量的方法，并对其结果进行了验证。相关系数、拟合优度系数、日内和日间精度均在验收标准之内，链格孢霉毒素在猪和肉鸡血浆中的定量限为5.0 ng/mL。

3.3 酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay)

除了上述传统的检测方法外，使用酶联免疫吸附法快速灵敏地检测交链孢菌毒素已成为近期研究的重点。Gross等[34]以天然污染的高粱粒和高粱为原料，以稳定的同位素稀释LC-MS法(SIDA)为参考方法，对TeA的ELISA进行了比较分析。ELISA检测高粱籽粒中LOD为30 μg/kg，高粱为220 μg/kg。SIDA在6～584 μg/kg(平均113 μg/kg)范围内对茶叶的阳性率为100%(n=28)。虽然ELISA法比SIDA法灵敏度低得多，但它可以作为高粱和高粱为基础的婴儿食品的筛选方法。

4 结 语

链格孢霉菌是一种能广泛侵染农作物、水果蔬菜的致病真菌，具有许多代谢产物，其中70多种被证实有明显的毒性，如致畸性、致死性、致癌性、致突变性、细胞毒性、急性毒性、胚胎毒性等。科学家们主要关注的4种链格孢霉毒素为AOH、AME、TeA及TEN。这四种毒素常在谷物、水果、蔬菜、油料作物中被检出，且有些检出率极高，被污染的农作物遍布世界各地，能引起许多农作物病害。欧洲食品安全局已经对链格孢霉毒素进行了评估，结果表明随着食品摄入的AOH与AME会对人体产生危害，并且对TEN的摄入量进行了评估，其最大日摄入量阈值初步设为1500 ng/kg bw/d。鉴于其毒性、污染范围及对人体的潜在危害，中国与世界各国未来应加快速度建立链格孢霉毒素的限量标准，从而更好地为食品安全保驾护航。