橘红配方颗粒质量标准研究*

药雅俊，张府君，郝晶晶，甄会贤

(山西药科职业学院，山西 太原 030031)

橘红来源于芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥外层表皮。秋末冬初果实成熟后采收，用刀削下外果皮，然后晒干或阴干。橘红近年来在中药应用中逐渐广泛，研究发现，其含有挥发油[1]，黄酮类等化学成分[2]。且其含有的橙皮苷具有抑菌、抗炎和抗病毒、增强维生素C作用、对胃肠功能及平滑肌作用[3]、抑制皮肤色素沉着、抗癌作用、防止骨质疏松、预防心血管病、抗羟自由基氧化、对中枢神经系统的影响、降低胆固醇、治疗风湿[4]等药理作用。而中药配方颗粒质量稳定、储存和携带方便，更便于临床使用[5]。因此，橘红配方颗粒的开发研究具有重要意义。本实验通过对橘红配方颗粒质量标准的研究，为橘红配方颗粒的规范化制备和质量标准提供依据。

1 仪器与药品与试剂

1.1 实验仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，Waters2998检测器，Empower色谱工作站，美国沃特世公司；WD-9403C紫外仪，北京六一生物科技有限公司；CP214型电子分析天平(万分之一)，上海舜宇平科学仪器有限公司；AB135-S电子天平(十万分之一)，瑞士METTLER公司；SB-5200 DTDN 超声波清洗器，宁波新艺生物科技股份有限公司；RE-5205旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SB-800 DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；YC-015喷雾干燥机，上海雅程仪器设备有限公司。

1.2 药品与试剂

橘红饮片，购置于万民药房，经山西药科职业学院甄会贤副教授鉴定为《中国药典》(2015版)收载品种；硅胶G板(批号：20161102)，青岛海洋化工厂分厂有限公司；橘红对照药材(批号：111695-201608)，橙皮苷对照品(含量测定用，批号：110721-201617)，中国食品药品检定研究院；甲醇(色谱纯，批号：Lot No 161104290004)，瑞典欧森巴克化学公司；乙腈(色谱纯，批号：Lot No.12960217)，瑞典欧森巴克化学公司：娃哈哈纯净水。其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 橘红配方颗粒的制备工艺

称取橘红饮片适量，加水浸泡60 min，加热回流提取2次，每次1 h，第一次加12倍量水，第二次加12倍量水。滤出药液，合并滤液。将滤液置旋转蒸发仪中于60 ℃减压浓缩至相对密度为1.05～1.10，喷雾干燥(参数：进风温度200 ℃；出风温度60 ℃；进样流速8.0 mL/min)，即得。

2.2 质量标准研究

2.2.1 薄层色谱鉴别

取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，加热回流20 min，滤过，取滤液5 mL，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取橘红对照药材1.0 g，同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验[5]，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)为展开剂，展开约3 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上层溶液为展开剂，展至约8 cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，如图1所示。

图1 橘红配方颗粒薄层色谱图

2.2.2 指纹图谱的初步研究

(1)流动相的考察

表1 梯度洗脱条件

根据参考文献，选择甲醇-水等度洗脱考察，结果发现在等度洗脱条件下均不能实现同时分离，因此采用梯度洗脱的方法。本实验在参考文献[6]的基础上对流动相乙腈(A)-甲醇(B)-0.1%磷酸溶液(C)的梯度变化进行了考察，梯度洗脱条件见表1、表2，结果见图2、图3。综合考虑后调整为表2的梯度洗脱条件，该条件下，供试品出峰，各成分达到基线分离，峰型对称，分离效果相对最好，结果见图3。

图2 橘红配方颗粒HPLC图(表1条件)

表2 梯度洗脱条件

图3 橘红配方颗粒HPLC图(表2条件)

(2)指纹图谱的建立

①色谱条件。色谱柱：BDS HYPERSIL C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，甲醇为流动相B，0.1%磷酸溶液为流动相C，按表2进行梯度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：324 nm；进样量：10 μL。

②参照物溶液的制备。取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

③供试品溶液的制备。取本品粉末(过四号筛)约0.2 g，精密称定，加甲醇20 mL，加热回流1 h，放冷，转移至50 mL量瓶中，用少量甲醇分次洗涤容器和残渣，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

④测定法。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定，记录60 min的色谱图，即得。得到7个共有指纹峰，各共有峰之间分离度良好，通过与对照品图谱比较，3号峰即为橙皮苷，结果见图4、图5。

图4 橙皮苷对照品溶液HPLC图(3 橙皮苷)

图5 橘红配方颗粒HPLC指纹图谱图(3橙皮苷)

2.2.3 含量测定

①色谱条件。色谱柱：BDS HYPERSIL C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-水(40：60)为流动相；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：284 nm；进样量：10 μL。

②供试品溶液的制备。同“2.2.2 (2)指纹图谱的建立”项下“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液。

③对照品溶液的制备。取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

④系统适用性试验。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪测定(对照品溶液连续进样6次)，考察系统适用性，结果理论塔板数为2100(理论板数按橙皮苷峰计算应不低于 2000)、重复性RSD=0.3%、分离度3.56、对称因子1.03,均符合要求。橙皮苷对照品色谱图、橘红饮片色谱图及橘红配方颗粒色谱图见图6～图8。

图6 橙皮苷对照品HPLC图(1橙皮苷)

图7 橘红饮片HPLC图(1橙皮苷)

图8 橘红配方颗粒HPLC图(1橙皮苷)

⑤样品含量测定。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪测定，按外标一点法计算各样品橙皮苷的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 结 论

指纹图谱色谱方法的建立过程中发现等度洗脱条件下难以实现同时分离，因此采用梯度洗脱的方法。本实验在文献的基础上对流动相梯度洗脱条件进行了考察，最终发现以甲醇、乙腈、和0.1%磷酸水溶液按表2梯度洗脱[6]，在该条件下橘红中的各成分达到基线分离，峰形对称，分离效果较好，可作为橘红配方颗粒的HPLC指纹图谱的色谱条件，为后期规范的指纹图谱建立奠定基础。

供试品制备方法的考察中对比了加热回流和超声提取两种方法，结果发现加热回流提取得到的供试品溶液色谱峰之间分离度良好，可作为橘红配方颗粒指纹图谱的供试品提取方法。另外还对检测波长进行了考察，实验同时考察了283 nm[7]及其他波长下的响应值，通过综合比较发现在324 nm处每个峰响应值最好。所以本实验将324 nm作为检测波长。

本实验采用的含量测定及指纹图谱方法简便可行、准确、快速，样品处理步骤及色谱条件简单，方法可靠。可用于橘红配方颗粒的质量控制。