高效液相色谱串联质谱测定鸡、猪肉中万古霉素

陈 竹

(上海天祥质量技术服务有限公司，上海 200030)

食品安全逐渐成为最近几年各行各业最普遍关注的话题，增强食品检验，做好食品分析，在促进食品生产、管理和消费方面发挥着越来越重要的作用。目前万古霉素作为抗生素被一些养殖者和饲料生产企业在动物饲喂过程中添加，该药物可通过食物链进入人体，对人类生命构成了极大的威胁。目前万古霉素有多种测定方法，每个方法都有自己合适的基质以及检出限。比如色谱分析主要是根据混合物中不同物质的自身特性和相对运动来分离它们，以达到检测的目的和效果。色谱分离法具有分析速度快、选择性高、灵敏度高的特点，在食品检测中普遍应用，且检测质量相对较高。但是质谱法是在色谱分析的基础上开发的。它不仅可以检测食品中的农药残留，还可以进行色谱分析。这是鉴定纯物质最有效的方法之一。质谱法主要用于确定分子量，确定化学式和确定物质的结构，并已广泛用于临床，食品测试和药物生物化学领域。质谱分离效率高，检测灵敏度高，非常适合食品检测中农药残留的检测。由于对样品要求低、选择性好、分离速度快，可以实现多组农药的定性和定量分析，可以快速准确地分析农药残留的成分和组成，是检测农药和食品中的残留物的好方法。在质谱的应用中，有许多检测仪器。测试不同的物质时，必须选择相应的仪器以确保测试的准确性。在食品检验中，有必要根据样品和检验目的确定所需的检验设备，以使监测仪器的应用特性最大化。本实验主要建立用LCMSMS测定鸡肉猪肉中的万古霉素。

1 实 验

1.1 试剂耗材[1]

Waters TQ-S高效液相色谱串联质谱(配有电喷雾离子源)；Eppendorf高速冷冻离心机(8000 r/min)；分析天平(精确到0.1 mg)；分析天平(精确到0.01 mg)；超声波清洗器，科导；涡旋混匀器；均质器；氮吹浓缩仪；SUPELCO固相萃取装置；Waters-60 mg/3 mL或等效阳离子交换柱(MCX)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 μm*100 mm,1.7 μm)；乙腈 HPLC级；甲醇HPLC级；氨水AR级；甲酸AR级；甲酸HPLC级；乙酸铵HPLC级；三氯乙酸AR级；微孔滤膜0.22 μm有机滤膜。

1.2 标准品配置及储存[2]

标准物质名称：万古霉素；标准物质英文名称；vancomycin；标准物质CAS号：1404-92-6。

标准储备液：市售100 μg/mL，-18 ℃储存，有效期12个月；一级标准中间液 (1.0 μg/mL)：准确移取50 μL储备液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，4 ℃储存，有效期6个月；二级标准中间液 (100 ng/mL):准确移取100 μL一级标准中间液于1 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，4 ℃储存，有效期3个月。

曲线配置：线性范围1.0～20.0 ng/mL，用阴性样品基质溶液定容。

1.3 样品前处理[3]

提取：准确称量称取2 g(精确至0.1 mg)鸡肉或猪肉样品，加入5 mL 5%三氯乙酸：乙腈(4：1)溶液，涡旋混匀2 min，水浴超声15 min(注意超声仪水温不宜过高)，8000 r/min冷冻离心5 min，重复上述提取操作，合并提取液于10 mL容量瓶中，用5%三氯乙酸：乙腈(4：1)溶液定容至刻度线，充分涡旋混匀2 min，待净化。

净化：将Waters MCX柱安装好，依次用5 mL甲醇，5 mL 0.1%甲酸水溶液活化，准确移取2 mL待净化样液过柱，流速控制在0.3 mL/min，样液滴完后用5 mL甲醇淋洗，6 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液于40 ℃氮吹至干，用1 mL 0.1%甲酸水溶液复溶，过0.22 μm微孔滤膜后，供高效液相色谱串联质谱仪器测定。

1.4 高效液相色谱条件[4]

色谱柱：Waters Xbridge BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1%甲酸5 mmol乙酸铵溶液;

流速：0.3 mL/min；

进样量：5 μL；

柱温：45 ℃。

表1 液相方法流速及梯度

1.5 质谱条件[5]

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

检测方式：多反应离子监测(MRM)；

扫描方式：正离子模式；

离子源温度：150 ℃；

喷雾电压：3.5 kV；

锥孔电压：38 V；

脱溶剂气温度：450 ℃；

脱溶剂气流速：800 L/Hr。

1.6 监测离子对参数[6]

表2 万古霉素质谱信息

2 结果与讨论

2.1 实验图谱

图1为万古霉素标品图，图2为万古霉素曲线线形图，图3为鸡肉空白样品图，图4为鸡肉检出限加标图。

图1 万古霉素标品图

图2 万古霉素曲线线形图

图3 鸡肉空白样品图

图4 鸡肉检出限加标图

2.2 实验注意事项

(1)实验过程要有平行试验，空白实验，加标实验作为质控。

(2)按照确定的液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，响应值均应在仪器检测的线性范围之内，以色谱峰面积外标法定量，正离子扫描模式。

(3)被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同实验条件下，试样中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内，且试样谱图中各组分定性离子的相对丰度于标准工作溶液中定性离子的相对丰度，其允许偏差不超过下表规定的范围时，则可确定为样品中存在这种待测物。

定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差见表3。

表3 离子丰度比参考表

2.3 讨 论

质谱法是在色谱分析的基础上开发的。它不仅可以检测食品中的农药残留，还可以进行色谱分析。这是鉴定纯物质最有效的方法之一。质谱法主要用于确定分子量，确定化学式和确定物质的结构，并已广泛用于临床，食品测试和药物生物化学领域。质谱分离效率高，检测灵敏度高，非常适合食品检测中农药残留的检测。但是在实验过程中，发现按照提取剂比例不同，目标物及基质被萃取的也不同[2]，此次实验过程主要是在降低基质干扰提高回收率，例如提取剂的比例，不同比例萃取效果不一样，比如上样体积，上样体积越多，即使我淋洗液再多，它的基质干扰很强，本底噪音很高，于是尝试了减少样品量，在仪器响应能满足的情况下减少基质干扰，从而达到效益最大化。在保证标品的响应没有问题的前提下，再优化前处理，是此次尝试减少上样体积的原因。

3 结 论

本文参考较多的万古霉素相关文献资料建立了适合猪肉、鸡肉的万古霉素检测方法。所涉及的色谱柱流动相为实验室常见类型这点较为方便，只是对于提取剂的要求较高，并且适用基质不是那么全面。正常实验条件下，回收率均在75%及以上，回收率稳定偏上。实验前处理简单且仪器分析时间较短，较为适合样本量较大的实验室。