姜黄素对高氧诱导的新生小鼠视网膜病变及notch 通路的影响

张艳莉，张彤

早产儿视网膜病变 （retinopathy of prematurity，ROP）又称晶状体后纤维增生症，临床上表现为新生血管生成、视网膜缺血、增生性视网膜病变，病情严重者可导致失明，随着近几年早产儿生存率增加，ROP 发病率也随之增加，多发于低体重早产儿[1-2]。目前认为视网膜血管发育异常是ROP 的主要病因，因此缓解或阻止视网膜血管异常发育是当前治疗ROP 的热点[3]。姜黄素（Curcumin）是姜黄的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节机体免疫功能、调节血脂等药理作用[4-5]。最近研究表明，姜黄素可下调血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）表达水平，抑制血管生成和保护视网膜再灌注损伤[6-7]。Notch 信号通路作为生物体进化过程中高度保守的信号通路，可调控下游基因介导细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤生成、胚胎发育等生理病理过程，几乎涉及机体所有组织和器官[8]。最近研究发现notch 信号通路可调控下游因子影响微血管稳定性和血管生成[9]。姜黄素在ROP 中的应用及如何调节notch 信号通路未见相关报道，因此本研究构建高浓度氧（高氧）诱导的C57BL/6J 幼鼠视网膜病变（oxygen induced retinopathy，OIR）模型作为研究对象，检测不同浓度姜黄素处理后OIR 病症缓解情况，初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2～3 周龄新生SPF 级C57BL/6J 健康幼鼠96只，购自成都达硕科技生物有限公司，许可证号：SCXK（川）2018-020，雌雄各半，未断奶与哺乳母鼠共同饲养。动物房温度设置为（25±1）℃，湿度（60±10）%，安静无噪音，以12 h 为周期日光灯照明，实验动物均自由摄食、哺乳、饮水。

1.2 试剂与仪器

姜黄素（S31628，＞98%）购自上海源叶生物科技有限公司；阿帕替尼（MB3158，＞98%）购自大连美仑生物技术有限公司；偶氮蓝（EvanS 蓝）（A865881，98%）上海麦克林生化科技有限公司；兔抗鼠notch、兔抗鼠VEGF、兔抗鼠内参β-Actin、羊抗兔二抗购自美国Bioworld 公司；YKY-1200 型倒置二激发荧光显微镜购自上海永科光学仪器有限公司；Bio-Rad伯乐凝胶成像系统SYSTEM GelDoc XR+（1708195）购自美国BIO-RAD 公司。

1.3 实验分组及造模

实验分组：（1）对照组（CG）,灌胃给药0.2 mL 双蒸水；（2）高氧模型组（HOG）；（3）低剂量姜黄素组（LCG），剂量为20 mg/kg；（4）中剂量姜黄素组（MCG），剂量为50 mg/kg；（5） 高剂量姜黄素组（HCG），剂量为100 mg/kg；（6）阿帕替尼组（APG），剂量为30 mg/kg[10]。每组16 只，各组幼鼠体重、雌雄差异无统计意义（P＞0.05），姜黄素用双蒸水配制，灌胃给药，给药体积均为0.2 mL，每日1 次，给药治疗1 周[11]。

除对照组外，其余幼鼠建立高氧诱导模型：将出生1 周后的C57BL/6J 幼鼠与哺乳期母鼠在氧仓内共同饲养，以1.5 L/min 的流量向氧仓通入100%湿润医用氧气，控制氧气浓度在（75±2）%。在造模期间，每隔4 h 检测氧仓的浓度，以确保高氧环境，每天更换高氧环境中的哺乳期母鼠，同时观察幼鼠的生理活动情况，其余饲养方式按照常规方式进行，幼鼠在高氧环境中饲养5 d 后，回归正常饲养环境，鼠龄为第17 d 时，采用眼底检查法，检查前30 min 先用复方托吡卡胺滴眼液散大瞳孔，使用开睑器将眼睑分开，用前置镜进行眼底检查，确认模型均构建成功。检查2 h 后方可进食，并按照分组给药。

1.4 视网膜组织HE 染色

各组随机选取8 只C57BL/6J 幼鼠脱颈处死，立刻摘取眼球，右眼球用于HE 染色；左眼球剥离视网膜组织，用于测定notch、VEGF 蛋白表达情况。

各组幼鼠右眼均在4℃条件下用4%多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，将石蜡包埋的切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位连续切片 （约6 μm），HE染色，每组随机选取6 张切片，烘箱烘干，二甲苯脱腊10 min，将脱蜡后的切片依次用二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、蒸馏水洗脱，然后脱水。苏木素染色（5 min），盐酸乙醇分化（30 s），50℃温水浸泡5 min，然后脱水。伊红染色（2 min），脱水、透明、中性树胶封片，置于显微镜下观察并拍照。

1.5 视网膜内皮细胞核计数

将石蜡包埋的切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位连续切片（约6 μm），二甲苯脱蜡，乙醇梯度洗脱行抗原修复，PBS 清洗3 次，置于3%过氧化氢溶液中，PBS 清洗3 次，3%BSA 覆盖切片，滴加兔抗鼠VEGF（特异性标记内皮细胞）一抗，孵育过夜，滴加二抗，DAB 显色至棕黄色，苏木素复染，乙醇（含1%盐酸）分化，0.6%氨水反蓝，乙醇脱水、透明、封片，在显微镜下观察结果，每组取8 张切片，使用双盲法统计每只眼球每张切片突破内界膜的内皮细胞核数。注：（1）切片选取需避免视乳头处；（2）仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞核。

1.6 偶氮蓝灌注血管造影法视网膜铺片

各组随机选取8 只C57BL/6J 幼鼠，1%戊巴比妥钠0.06 mL/g 腹腔麻醉后，将其固定在简易手术台上，沿前肢与下领连线的中点，打开皮肤，分离一侧颈动脉用，用无菌注射器抽取偶氮蓝液体，针头沿固定后的颈总动脉血管走行刺入约3 mm，当幼鼠嘴唇变蓝后，取出针头，夹闭颈总动脉，脱颈处死幼鼠，立刻摘取眼球。使用多聚甲醛（4%）固定0.5 h 后取出，在显微镜下观察，用虹膜剪沿角巩膜缘剪开，去除晶体、玻璃体及角膜，沿角巩膜边缘将巩膜壁剪一缺口（操作过程中勿碰触视网膜），将视网膜剥离，剪成花瓣状，平铺于无菌的载玻片上，封片，避光保存，在荧光显微镜下观察拍照。

1.7 各组视网膜notch、VEGF 蛋白表达水平测定

采用蛋白印迹法（western blotting，WB），将1.3中左眼视网膜组织加入含有蛋白酶抑制剂的200 μL裂解液，研磨至无组织碎块，离心取上清。严格按照BCA 试剂盒说明书测定样品总蛋白含量。加入样品1/4 体积的5×上样缓冲液，加热至100℃，保持5 min。调整稳压电源至100 V，稳压电泳，当样品进入分离胶后，增大电压至120 V，当上样缓冲液到达分离胶底部时，湿法转膜，5%的脱脂奶粉室温封闭结合位点1 h。加入兔抗鼠notch（1:1000）、兔抗鼠VEGF（1:1000）、兔抗鼠内参β-Actin（1:1000），4℃孵育过夜，用PBS 清洗3 次，加入羊抗兔二抗（1:1000），25℃孵育，PBS 清洗3 次，显色剂显色、曝光、凝胶成像设备观察。

1.8 统计学方法

使用SPSS22.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）形式表示，多组比较行单因素方差分析，两组均数相比行SNK-q 检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高氧诱导的新生幼鼠视网膜病模型的验证

正常环境饲养的C57BL/6J 幼鼠视网膜大血管管径粗，分支清晰呈放射状均匀分布，高氧诱导后，C57BL/6J 幼鼠视网膜毛细血管出现内皮增殖小结，血管呈小球状，可见小出血及水肿，虹膜周边有粘连，提示高氧诱导的新生幼鼠视网膜病模型构建成功（图1）。

图1 对照组和高氧模型组幼鼠眼底图。1A 对照组（CG）；1B 高氧模型组（HOG），箭头示血管呈小球状，可见小出血及水肿

2.2 高氧诱导的新生幼鼠视网膜组织HE 染色

对照组视网膜内界膜结构均一，未见有明显的血管内皮细胞突破内界膜。HOG组视网膜内界膜结构不完整，有大量血管内皮细胞突破内界膜。姜黄素给药后，随剂量增加，视网膜内界膜结构逐步恢复完整，突破内界膜的血管内皮细胞数逐渐减少，HCG组OIR 症状明显得到改善，缓解程度与APG组相当（图2）。

2.3 高氧诱导的新生幼鼠视网膜内皮细胞核计数

突破视网膜界膜血管内皮细胞数： 与CG组（1.20±0.26）个相比，HOG组（21.16±1.23）个，显著增加（q=81.42，P=0.000）；与HOG组相比，LCG组（14.49±0.53）个、MCG组（10.14±0.62）个、HCG组（7.45±0.42）个依次减少（q=27.21、44.95、55.93，P 均=0.000）。APG组（7.09±0.68）个与HOG组相比显著减少（q=57.39，P=0.000），与HCG组相比差异无统计学意义（q=1.469，P=0.902）（图3）。

图2 高氧诱导的新生小鼠视网膜组织HE 染色（×200）。2A 对照组；2B 高氧模型组；2C 低剂量姜黄素组；2D 中剂量姜黄素组；2E 高剂量姜黄素组；2F 阿帕替尼组

图3 视网膜组织VEGF 免疫组化染色（×100）。3A 对照组；3B 高氧模型组；3C 低剂量姜黄素组；3D 中剂量姜黄素组；3E 高剂量姜黄素组；3F 阿帕替尼组

2.4 偶氮蓝灌注血管造影法视网膜铺片

对照组可见视网膜血管自视盘发出的大血管向四周呈放射状均匀分布，血管基本成熟，管径粗，分支好，周边血管网状结构清洗，管径粗，分支好，走行规整。HOG 型组大血管明显变细，分支减少，行走紊乱，视网膜远周及中央可见无灌注取，周边血管密度增加，可见大量渗漏点，血管丧失放射状结构。姜黄素给药后，随剂量增加，视网膜大血管逐渐变粗，血管行走逐渐规整，分支增多，周边网膜清晰，HCG组OIR 症状明显得到改善，缓解程度与APG组相当（图4）。

2.5 高氧诱导的新生幼鼠眼球组织中notch、VEGF蛋白表达水平

notch 蛋白表达:与对照组相比，HOG组notch蛋白表达水平显著升高（q=28.01，P=0.000）；与HOG组相比，LCG组、MCG组、HCG组notch 蛋白表达水平依次下降 （qLCG=10.57，qMCG=17.69，qHCG=22.36，均P=0.000）。APG组notch 蛋白表达水平与HOG组相比显著下降（q=22.61，P=0.000），与HCG 相比差异无统计学意义（P＞0.05）（图5 和表1）。

VEGF 蛋白表达:与对照组相比，HOG组VEGF蛋白表达水平显著升高（q=25.68，P=0.000）；与HOG组相比，LCG组、MCG组、HCG组VEGF 蛋 白表达水平依次下降（qLCG=5.49，P=0.005；qMCG=14.27，P=0.000；qHCG=18.88，P=0.000）。APG组VEGF 蛋白表达水平与HOG组相比显著下降 （q=19.10，P=0.000），与HCG组相比差异无统计学意义 （P＞0.05）（图5，表1）。

图4 偶氮蓝灌注血管造影法视网膜铺片。4A 对照组；4B 高氧模型组；4C 低剂量姜黄素组；4D 中剂量姜黄素组；4E 高剂量姜黄素组；4F 阿帕替尼组

图5 高氧诱导的新生小鼠眼球组织中notch、VEGF蛋白表达水平。A 对照组；B 高氧模型组；C 低剂量姜黄素组；D 中剂量姜黄素组；E 高剂量姜黄素组；F 阿帕替尼组

表1 高氧诱导的新生小鼠眼球组织中notch、VEGF蛋白表达水平（，n=8）

表1 高氧诱导的新生小鼠眼球组织中notch、VEGF蛋白表达水平（，n=8）

注：a 与HOG组相比，P＜0.05；b 与LCG组相比，P＜0.05；c 与MCG组相比，P＜0.05

3 讨论

目前ROP 已成为早产儿失明的主要原因，占世界上儿童致盲病因的5%～20%[12]。ROP 发病机制分为高氧条件下血管关闭、消失和相对缺氧条件下血管异常增长。本研究选择近交系的C57BL/6J 幼鼠，根据Smith 等[13]建立的方法构建高氧诱导的新生小鼠视网膜病变模型。本研究采用眼底检查法证明高氧诱导的C57BL/6J 新生小鼠OIR 模型构建成功，与对照相比，高氧模型组视网膜内界膜结构不完整，有大量血管内皮细胞突破内界膜，突破视网膜界膜血管内皮细胞数显著增加，大血管明显变细，分支减少，行走紊乱，视网膜周边及中央可见无灌注区，周边血管密度增加，可见大量渗漏点，血管丧失放射状结构，说明高氧模型组新血管增生、形态异常，未形成正常的血管屏障，提示本研究成功构建高氧诱导C57BL/6J 幼鼠视网膜病变模型。

姜黄素以药理作用广，副作用小成为目前研究的热点之一[14]。研究发现，姜黄素能够上调视网膜神经细胞中Thy-1 表达水平，以缓解急性高眼压家兔视网膜神经细胞损伤，提示姜黄素可能对视网膜具有一定的保护作用[15]。何琼等[16]发现姜黄素治疗糖尿病大鼠后视网膜病变较轻，Ets-1 表达水平下调，提示姜黄素可能抑制Ets-1 表达水平，从而缓解糖尿病视网膜病变症状。随后研究也证实姜黄素改善糖尿病引起的视网膜变薄、神经节细胞、内核层细胞凋亡、毛细血管基底膜增厚和光感受器细胞膜紊乱等症状[17]。本研究发现，与高氧模型组相比，低、中、高剂量姜黄素后，OIR 幼鼠视网膜内界膜结构逐步恢复完整，突破内界膜的血管内皮细胞数减少，视网膜大血管变粗，血管行走规整，分支增多，周边网膜清晰，呈剂量依赖性，且高剂量姜黄素与阿帕替尼药效相近，说明经治疗后，OIR 幼鼠视网膜病变症状得到缓解，血管生长趋向正常，提示姜黄素能够缓解OIR 幼鼠视网膜病变症状，有望成为治疗ROP 的备选药物。

随着新生儿血管发病机制的进一步研究，早产儿视网膜血管发育不完整，导致视网膜缺血，进一步引起新生血管形成且伴有纤维化，致使视网膜病变、脱离，因此从血管生成抑制方面研究如何预防或治疗ROP 意义深远。VEGF 在糖尿病视网膜患者血清中高表达，说明VEGF 与血管内皮功能、微血管损伤相关[18]。黄黎黎等[19]研究表明拮抗VEGF 治疗能够改善视网膜微血管功能和黄斑水肿，增强激光疗效。本研究发现，与对照组相比，高氧模型组视网膜组织中VEGF 表达水平显著升高，提示幼鼠OIR 进程中VEGF 高表达。与高氧模型组相比，低、中、高剂量姜黄素组视网膜组织中VEGF 蛋白表达水平显著下降，呈剂量依赖性，且高剂量姜黄素与阿帕替尼作用一致，提示姜黄素可抑制OIR 幼鼠视网膜组织中VEGF 表达，从而缓解幼鼠OIR 症状，但是姜黄素通过何种通路下调VEGF 表达水平还有待进一步研究。研究发现姜黄素可能通过阻断Notch 信号通路，抑制NF-kB 的表达，下调肿瘤组织中VEGF 表达水平，抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长[20]。贺桂芳等[21]研究表明姜黄素PDT 可有效阻断Notch 信号通路，抑制宫颈癌细胞增殖。本研究表明，与对照组相比，高氧模型组视网膜组织中notch 表达水平显著升高，提示notch 信号通路可能参与幼鼠OIR。进一步分析发现，与高氧模型组相比，低、中、高剂量姜黄素组、阿帕替尼组视网膜组织中notch 表达水平显著下降，呈剂量依赖性，高剂量姜黄素组与阿帕替尼组相比无差异，提示姜黄素能够下调notch 表达水平，可能通过阻断notch 信号通路而缓解幼鼠OIR 症状。

综上所述，姜黄素可能通过阻断notch 信号通路，抑制VEGF 表达，减少血管异常增生，进而缓解幼鼠OIR 症状，推测姜黄素有望成为临床上治疗ROP 的备选药。但由于本研究小鼠模型实验样本量小，且不能完全代表早产儿ROP 的发病过程，该研究结果需要进一步扩大样本量和从细胞水平研究加以验证。