GATA3对耳蜗发育和功能维持的作用

翁健俏，贾 凡，徐 梅，梁国庆，孙 霞

(1. 杭州师范大学医学院，浙江 杭州 311121； 2. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121)

0 引言

内耳是由耳蜗和前庭系统组成的复杂结构，介导人类及其他哺乳动物的声音和平衡感知.柯蒂氏器(Organ of Corti，OC)是耳蜗的核心听觉元件[1].OC的螺旋神经节细胞(spiral ganglion neurons, SGNs)和毛细胞(Hair cells, HCs)的不可逆转性丢失是造成感觉神经性耳聋的主要原因.内耳的结构高度特异与复杂，其发育过程受精准的遗传调控[2].已知有多个转录因子起决定作用，它们之间通过交互作用调控内耳的发育[3-4].

GATA家族转录因子通过锌指DNA结合区域与DNA上的5’-(A/T)GATA(A/G)-3’序列结合[5].6种GATA因子(GATA1-6)在不同的组织中表达，对细胞命运决定、分化、增殖和运动等有重要作用[5].Gata3单倍体剂量不足(haplo-insufficiency)引起人类HDR综合征(HDR Syndrome, Hypoparathyroidism, Sensorineural Deafness and Renal Disease).一些研究揭示了Gata3在肾脏和甲状旁腺发育过程中所起的作用[6-7]，但Gata3如何调节听觉系统的发育和功能维持还不甚清楚.Gata3在早期耳板上广泛表达，随后限制在前感觉神经区[8-9]，并在腹侧听囊(耳蜗原基)高表达[10].Gata3定点突变影响耳蜗的早期形态发育[10].Gata3在耳蜗感觉神经细胞发育和感觉神经相关基因如Eya1、Six1和Sox2等的信号传递通路中必不可少[11].

从胚胎期OC与SGNs的发育、特异化开始，直到出生后结构和功能成熟，Gata3一直在OC持续表达[12-14].出生后2、5、8 d，柯蒂氏器中Gata3的mRNA表达水平也很稳定[13].尽管Gata3在柯蒂氏器的毛细胞中的表达随时间有所下调[15]，但在支持细胞中仍有表达[12, 14].Gata3在出生后耳蜗的持续表达提示其极有可能在耳蜗发育后及成体阶段的功能维持中起作用.

本研究推测Gata3可能通过参与成体耳蜗HCs的功能和存活过程，影响成体耳蜗的正常功能.已有研究构建了Gata3loxp/loxp；Oto-cre条件性基因敲除系统(conditional knockout, CKO),用于研究Gata3对成体小鼠耳蜗内毛细胞(inner hair cells, IHCs)的功能成熟和神经分布的影响[16].由于Otc基因在E16 ～ E18开始主要在IHCs表达，在外毛细胞(outer hair cells，OHCs)几乎不表达，且在P3时才达到峰值，不适合对耳蜗所有类型HCs发育成熟后的结构形成和维持的研究[16-18].本研究构建了Gfi1-cre条件基因敲除系统，实现了Gata3在胚胎期耳蜗以及成体耳蜗中所有类型HCs的特异性敲除.通过免疫荧光技术从细胞和分子水平研究耳蜗相关细胞和结构的改变，探讨Gata3在成体耳蜗中的调控功能和相关机制.

1 材料和方法

1.1 实验动物

采用野生型C57BL/6小鼠和特异性敲除Gata3的转基因突变小鼠和Gfi1-cre小鼠.小鼠由甘霖实验室构建并赠予,饲养于杭州师范大学实验动物中心，SPF级，室温18-20 ℃.实验分为野生型组和突变组.Gfi1-cre小鼠和Gata3loxp/loxp小鼠交配，最终得到不同品系的突变小鼠Gata3-/-亦即Gata3-Null突变类型小鼠.本实验经浙江省杭州师范大学动物和使用中心批准，并在其监督下进行.

1.2 小鼠基因型鉴定

小鼠胚胎时期以当日午间见栓为 E0.5 推算；出生小鼠以出生当天记为P0.取P10小鼠脚趾2-3 mm，50 mM NaOH裂解液法获取PCR底物.琼脂糖凝胶电泳及成像分析PCR 结果进行基因型鉴定.

1.3 冰冻切片处理

小鼠胚胎的取样：颈椎脱臼法处死母鼠，取出子宫置于4 ℃的冰PBS中，解剖出胚胎，4% PFA于4 ℃固定，置于4 ℃摇床摇1-2 h，PBS洗涤2次，每次15 min.将胚胎置于30%蔗糖脱水过夜后OCT包埋，-80 ℃保存.出生后小鼠内耳的取样：颈椎脱臼法处死小鼠，取出内耳放置于4 ℃的冰PBS中，去除多余的组织，4% PFA于4 ℃固定，置于4 ℃摇床摇1-2 d，成年小鼠的内耳需固定34 d；BS洗涤两次，每次1 520 min，加入EDTA溶液进行脱钙处理，脱钙时间7 d PBS洗涤两次，每次1 520 min，将胚胎置于10%蔗糖溶液、15%蔗糖溶液、20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液进行梯度脱水后过夜，最后用OCT包埋，-80℃保存.

1.4 免疫荧光方法

取-80 ℃ OCT包埋的耳蜗组织做冰冻切片，切片厚度为 20 μm；将片子置于55 ℃烘箱2 d；2% PBST洗2次；加入 2% BSA室温(RT)封闭 1 h；再加入用 2% BSA 稀释的一抗，放置于4 ℃过夜；用2% PBST漂洗，共4次,加入2% BSA稀释的二抗，用2% PBST 1×PBS 溶液静置清洗，再用1×PBS漂洗2次；加入200 μL DAPI 在PBS(1∶5 000)中,避光5 min；再用PBS洗1次.

1.5 全耳蜗(wholemount)免疫荧光

颈椎脱臼法处死母鼠，取出子宫置于4 ℃的冰PBS中，解剖出胚胎或成体小鼠内耳；耳蜗加入胶原酶(1 mg/mL)和中性蛋白酶(1 mg/mL)，时间根据耳蜗软化情况定.将取出的耳蜗管置于EP管中4% PFA 4 ℃固定30 min，成年小鼠耳蜗置于EP管中4% PFA 4 ℃固定过夜；根据抗体类型选择柠檬酸抗原修复，柠檬酸抗原修复液加热到 95 ℃，将耳蜗管加入修复液，液体保温修复15 min；一抗和二抗封片处理.

1.6 统计方法

所有数据至少代表3个独立实验.数据以均数±标准差(SD)表示.使用GraphPad Prism 8软件，并用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P值<0.05为差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 Gata3条件性敲除转基因小鼠品系的建立

通过将Gata3基因4号外显子两端插入loxp序列，建立了Gata3loxp/loxp条件性基因敲除小鼠(图1A).Gata3基因的4号外显子编码转录因子与DNA结合的第一个锌指结构；去除这段序列，将生成一个无功能蛋白，并造成5号外显子阅读框移位，形成终止密码.本研究利用Gfi1-cre品系和Gata3loxp/loxp品系小鼠杂交，在CKO小鼠OC的毛细胞内特异性表达重组酶(Cre recombinase)，从而条件性地使毛细胞内的GATA3失活(图1B).Gfi1从E15.5开始，耳蜗只在毛细胞内表达[19].小鼠基因型分析时(图1C)，Gata3loxp/loxp条带大小为 303 bp，野生型条带为 263 bp，Gfi1-cre条带是cre条带为416 bp，野生型无对应cre条带.鉴定时每只小鼠同时带有Gata3纯合条带和一条cre条带，结果为条件性敲除的小鼠，标为Gata3-Null.从胚胎和成体小鼠外观和成体小鼠活力看来，Gata3loxp/loxp纯合小鼠、CKO的Gata3-Null小鼠与野生型小鼠无明显差异.

A: Gata3loxp/loxp小鼠基因结构图和限制性内切酶图谱黄色框为Exon 4.红色三角为loxp序列.黑色三角为Frt序列.粗线为打靶载体(targeting vector)和Gata3基因序列的同源重组臂.绿色箭头是基因型鉴定的引物位置. B: 获得Gata3-Null小鼠的遗传杂交图. C: 小鼠基因鉴定结果.(Lan e 1) 为野生型.(Lane 2)为Gata3loxp/loxp；Gfi1-cre杂合子(Lane 3)Gata3loxp/+纯合子(Lane 4)为Gata3loxp/loxp纯合子.右侧数字单位bp.

2.2 条件性敲除Gata3的效率分析

Gata3在小鼠内耳的发育过程中持续表达.本研究利用抗Gata3免疫组化方法，观察到Gata3在E9.5时开始在整个听囊(otocyst)表达.表达出截断的GATA3蛋白质，由于缺乏进入细胞核的引导序列，从而只能停留在细胞质内[20-22].本研究中使用的GATA3抗体可以识别截断的GATA3. E11.5到E12.5Gata3的表达局限于听囊的背侧和中腹部.E15.5到出生后，OC发育基本成型(图 2F)，期间可见支持细胞和毛细胞内持续表达Gata3(图 2A-E).MYO7A在毛细胞的细胞质内表达，一般被用作毛细胞的Marker.在鉴定Gfi1-cre驱动的CKOGata3-Null小鼠的敲除效率时，本研究发现从E15.5开始到P5，Gata3-Null小鼠的毛细胞核内不再表达GATA3，而同期野生型对照的毛细胞核内表达明显(图 2G-2K).此期未见OC的结构异常，但发现突变体与野生型对照相比较，紧邻毛细胞下的支持细胞核内的Gata3表达有降低现象.提示Gata3在毛细胞的表达水平与支持细胞的表达水平之间存在某种联系.

A-E: Gata3在E15.5，E18.5，P0和P5期野生型小鼠毛细胞内和支持细胞内均有表达，且表达强度没有明显差异. F: P0期OC的发育完成，各种结构都已形成.G-G″:Gata3表达在野生型小鼠毛细胞核内.H-H″:E15.5时Gata3-Null小鼠毛细胞内的GATA3表达于核外.I-I″:P5时邻近毛细胞底部的支持细胞与外侧的支持细胞相比较表现出Gata3表达降低的情况.J-J′和K-K′：P5时毛细胞和支持细胞Gata3表达差异的放大图.#所示为内毛细胞，+所示为外毛细胞，^所示为支持细胞所示比例尺为20 μm.

2.3 条件性敲除Gata3后对耳蜗其他细胞和结构的影响

已有多项研究确认内耳的发育受众多基因的调控，其中有很多重要的转录因子[3, 23-28].Sox2(编码Sry-related HMG box transcription factor)基因隶属于Sox转录因子家族，是耳蜗毛细胞(听觉受体细胞)发育的关键基因，对毛细胞祖细胞的增殖有重要影响[29].Sox2在毛细胞和支持细胞中的表达不一致，提示OC细胞分化和结构形成过程中Sox2受其他因素的影响.本研究发现，在E15.5敲除Gata3后(图2H-H″)，P0前Gata3-Null小鼠Sox2的表达模式与野生型无明显差异.虽然E18.5时野生型小鼠毛细胞已经停止表达Sox2(图 3A-A″；a-a″)；但在P0时Gata3-Null小鼠内毛细胞内持续表达Sox2(图 3B-B″；b-b″).提示Gata3基因在决定毛细胞命运和维持其结构和功能方面有比较广泛和关键的影响.

A-A″:P0期的Gata3-Null小鼠的毛细胞被MYO7A标记,位置在细胞质内.此时Sox2只在内毛细胞核内表达,用粉色箭头指示.a-a″为A的局部放大图.B-B″:P0期野生型小鼠的毛细胞被MYO7A标记.此时Sox2在毛细胞核内不表达.粉色箭头所指为内毛细胞核所在位置.b-b″为B的局部放大图.所示比例尺为20 μm.图3 条件性敲除后Gata3对其他转录因子基因的影响Fig.3 Effects on other transcription factor genes in the cochlea after conditional knockout of Gata3A-B:用wholemount分别显示P23时突变体和野生型小鼠的耳蜗中段(middle)部分毛细胞的分布情况.E:所示为耳蜗wholemount整体结构深红色线段指示耳蜗basal, middle & apex的大致分界;黄色透明框表示CD取材的位置.F:对A-B的毛细胞数量做的对比和统计n=3.所示比例尺为20 μm.图4 Gata3缺失对成体耳蜗毛细胞数量和排列的影响Fig.4 Effects of Gata3 deletion on the number and arrangement of adult cochlear hair cells

2.4 Gata3 缺失导致毛细胞数量减少和排列紊乱

已有的研究发现GATA3的缺失导致内耳和听觉神经的形态学变异[30-31].胚胎早期Gata3在耳蜗的感觉区域表达，并调节螺旋神经节(SGN)的存活，可能是人类HDR综合征的分子机制[32].Gata3在胚胎发育后期和出生后持续表达在毛细胞内；此现象虽然提示Gata3在毛细胞的后期发育成熟及功能和结构维持中起到作用，但其细胞学机制一直不清楚.本研究发现，E15.5时敲除Gata3后到出生后5 d(P5)，毛细胞及其所在OC形态学结构正常.但本研究观察到P23时，Gata3-Null小鼠毛细胞数量明显减少，且失去了有序排列方式(图 4A-D).其中内毛细胞的减少尤其明显(图 4F).同时选取了Gata3-Null和野生型小鼠耳蜗的wholemunt结构中区(middle)部分(图 4)，以毛细胞的标记物Parvalbumin显示毛细胞的数量和排列方式，观察和统计了二者之间的差别.

3 讨论

本研究中使用的Gata3loxp/loxp;Gfi1cre/+小鼠可以存活、繁育，且外观和行为没有遗传缺陷.免疫荧光分析胚胎期和P5前毛细胞的发育状况，发现Gata3loxp/loxp;Gfi1cre/+小鼠耳蜗的毛细胞与野生型小鼠相比没有明显差异.免疫荧光分析确认 E15.5至P5期间，毛细胞中的Gata3可以被敲除.支持细胞中Gata3的表达量有所下降，但毛细胞的数量和排列并没有发生改变.P23耳蜗wholemount免疫荧光分析，发现Gata3-Null小鼠与野生型小鼠相比毛细胞的数量明显下降，且排列紊乱.表明GATA3对成体耳蜗毛细胞和结构维持起到重要作用.需进一步研究Gata3对其他基因的影响和相应的作用机制.

Sox2是成熟OC支持细胞的标记，在P0后只在支持细胞表达[3].本研究发现P0内毛细胞延迟表达

SOX2.Sox2在神经管细胞以及中枢神经系统祖细胞增殖过程中表达[12].然而，在祖细胞退出细胞周期，进入G0期的过程中Sox2的表达会下调，其与GATA3的交互作用可能在P0体现出来，并对后期的OC结构和功能产生影响.

本研究发现Gata3对成体的耳蜗毛细胞的数量和排列方式的维持有重要作用，提示进一步研究的必要性.GATA3对成体耳蜗，特别是对高龄小鼠耳蜗的影响，需要更多的数据，研究结果将对人类早老性耳聋和人类HDR综合征的机制研究提供线索.