超高压处理对复合苹果泥微生物和品质的影响

冯若怡,王晓钰,杨云舒,赵 靓,王永涛,廖小军

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,国家果蔬加工工程技术研究中心,农业部果蔬加工重点实验室,食品非热加工北京市重点实验室,北京 100000)

在众多果蔬制品中,果蔬泥因方便快捷、可不经咀嚼直接吞咽,口感纯厚、具有丰富的营养和特有的果蔬风味,受到了儿童、老人等特殊人群的喜爱[1]。因此,开发天然的果蔬泥将具有广阔的市场前景。

表1 复合苹果泥感官评价标准

但目前市场上所售果蔬泥产品多采用浓缩汁热杀菌,使得这类果蔬泥产品的营养、风味、色泽等品质损失较严重,亟需向非热加工进行转变。超高压技术(High hydrostatic pressure,HHP)是非热加工技术中研究最多、商业化程度最高的一种,其在有效杀菌的同时,使食品达到灭酶和改变物性等目的[2-3]。HHP具有温度变化小、只作用于非共价键、瞬间压缩、作用均匀等优点,能够很好地保持食品天然的色、香、味、质构和营养等品质,在食品上的应用也越来越广泛。因HHP对高水分含量食品的适用性,使得HHP果蔬汁和饮料的加工生产达到了超高压食品20%的市场份额,其中果蔬汁加工的商业化生产已经走向成熟[4]。

而目前超高压应用于复合果蔬泥的研究较少,基于此现状,本研究通过选用高品质的新鲜果蔬泥来代替浓缩汁,用超高压杀菌代替热杀菌并研究其对品质的影响,以期为超高压技术在果蔬泥加工中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果 产地山东,品种为“红富士”的外观新鲜、无外伤腐烂的苹果;猕猴桃 产地陕西,品种为“中华猕猴桃”的外观新鲜、软硬适中的猕猴桃;胡萝卜 产地福建,品种为“助农七寸”的外观新鲜、色泽明亮的胡萝卜;平板计数培养基、孟加拉红培养基 北京奥博星生物技术责任有限公司;氯化钠、氢氧化钾、无水甲醇、乙酸、盐酸、三水乙酸钠、偏磷酸、二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠 北京化工厂;福林酚、没食子酸、1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)、2,4,6-三(2-吡啶)-1,3,5-三吖嗪(2,4,6-tris(2-pyridine)-1,3,5-triazine,TPTZ)、交联聚乙烯吡咯烷酮(Crosslinking polyvingypyrrolidone,PVPP)、VE衍生物(Trolox) 上海源叶生物公司;无水氯化铁、碳酸钠、石油醚 国药集团化学试剂有限公司;果胶、抗坏血酸、2,6-二氯靛酚、高岭土 北京索莱宝科技有限公司;以上试剂均为分析纯。

JYL-C051型九阳料理机 九阳股份有限公司;HHP-30 L型超高压处理设备(30 L) 包头科发高压科技有限责任公司;S-HH-W21-Cr600型恒温水浴箱 北京长安科技仪器厂;HWS70B型电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司;LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;Color Quest XE型色差仪 美国Hunterlab;DR-A1型阿贝折射仪 广州市爱拓科学仪器有限公司;UV-1800型可见分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司;CR21GIII高速冷冻离心机 日本日立公司;LS230型激光颗粒粒度分析仪 美国贝克曼公司;AR1000型流变仪 美国TA仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复合苹果泥的制备 选取新鲜成熟的苹果、猕猴桃、胡萝卜清洗切块。根据预实验将苹果、猕猴桃、胡萝卜按质量比3∶2∶1、4∶2∶1、5∶2∶1、6∶2∶1、5∶3∶1、6∶3∶1混合,室温下榨汁机打浆3 min。将制备的苹果泥立即分装到1210 cm高温蒸煮袋中,50 g/袋。

1.2.2 感官评价 制备好复合苹果泥后,立即进行感官评价。对样品的口感、颜色、光泽、组织状态以及风味各项指标进行评分。将不同比例的复合苹果泥分装到品尝杯中并随机编号提供给10名经过培训的感官评价员进行品评。分数越高,说明产品的接受度越高。

1.2.3 超高压处理和热处理 前期进行的预实验表明超高压处理和未处理的苹果泥感官评分具有相似性,因此考虑到可行性,采用未处理的产品的感官评分作为参考,按感官评分最高的配比制备苹果泥样品。分别进行超高压和热处理,固定超高压压力分别为400和500 MPa,保压时间依次为2、5、8、10 min,将样品置于设备中,在室温下进行超高压处理。热处理组将苹果泥置于水浴锅中,中心温度达到90 ℃后加热2 min,立刻进行指标测定。

1.2.4 微生物测定 菌落总数及霉菌和酵母菌作为微生物检测指标,根据GB 4789-2010的相关操作进行微生物菌落计数。待培养基凝固后将平板计数琼脂培养基于37 ℃倒置培养48 h、孟加拉红培养基于29 ℃培养72 h以上。

1.2.5 pH测定 待测样品倒入烧杯中并搅拌均匀,插入pH计测量头在室温下进行测定。

1.2.6 可溶性固形物(Total soluble solids,TSS)的测定 使用阿贝折射仪测定。蒸馏水进行校零,取适量样品放于棱镜上测量,每次测量后用蒸馏水清洗。

1.2.7 色差测定 将样品放置于比色皿中,测定样品的L*、a*、b*值。其中L*代表样品的亮度;a*代表红绿程度;b*代表黄蓝程度。ΔE代表被测样品与未处理之间总体颜色变化。通过下面公式计算ΔE。

1.2.8 总膳食纤维含量测定 总膳食纤维含量测定根据GB 5009.88-2014的相关操作进行。对样品进行蛋白酶解,在室温下用乙醇沉淀1 h,将沉淀液抽滤,用78%乙醇、95%乙醇、丙酮洗涤残渣2次,抽滤去除洗涤液后,将坩埚连同残渣在105 ℃烘干过夜。按下式进行计算:

式中:X表示样品中总膳食纤维的含量,g/100 g;mR表示样品残渣质量,g;mP表示样品残渣中蛋白质量,g;mA表示样品残渣中灰分质量,g;mB表示样品空白质量,g;m表示取样质量,g;f表示制备过程中质量变化的校正因子。

1.2.9 总酚测定 采用Folin-Ciocalteu试剂法并略作修改。取10 g样品,加入20 mL无水乙醇,于4 ℃静置提取30 min,10000×g、4 ℃下离心10 min,取上清液待用。提取液稀释一倍,与福林酚试剂充分混合,再向混合液加入7.5%的碳酸钠溶液,室温避光反应1 h,用分光光度计测定765 nm处吸光值,总酚含量以每100 g样品含有的没食子酸表示。

没食子酸标准曲线的制作:配制没食子酸标准溶液。取0.4 mL不同浓度的没食子酸溶液分别与2 mL稀释10倍的福林酚试剂反应,迅速用分光光度计测定765 nm处吸光值,得到标准曲线,Y=0.011x+0.038(R2=0.995)。

1.2.10 抗坏血酸含量测定 按GB 5009.86-2016测定并略作修改。准确称取10 g样品,用偏磷酸定容至100 mL,摇匀后加入4 g高岭土脱色,11000×g,4 ℃离心15 min,取上清液10 mL于锥形瓶中,用标定过的2,6-二氯靛酚溶液滴定,至溶液呈粉红色且15 s内不褪色,同时作空白试验。

1.2.11 胡萝卜素含量的测定

1.2.11.1 总类胡萝卜素含量测定 参考刘凤霞的方法,并略作修改[5]。3 g复合苹果泥加入100 mL丙酮中,60 W超声提取 15 min,重复两次并合并提取液,加入等体积的10% KOH-甲醇溶液,混合均匀后在50 ℃恒温箱皂化3 h,冷却至室温后移至分液漏斗中,加入石油醚振荡萃取,静置分层后合并有机相水洗至中性,用无水硫酸钠的砂芯漏斗过滤除水,滤液置于圆底烧瓶中,(40±2) ℃旋蒸至近干,用正己烷溶解残渣定容。定容后的提取液于450 nm波长下测吸光度,用正己烷作对照。

1.2.11.2β-胡萝卜素含量测定 按GB 5009.83-2016测定,并略作修改。色谱条件为:色谱柱为C18柱,柱长250 mm,内径4.6 mm,粒径5 μm;流动相为三氯甲烷∶乙腈∶甲醇=3∶12∶85,含抗坏血酸0.4 g/L,经0.45 μm膜过滤备用;流速为2.0 mL/min;检测波长为450 nm;柱温为(35±1) ℃;进样体积为20 μL。

1.2.12 抗氧化能力的测定 10 g复合苹果泥样品加入20 mL无水甲醇,4 ℃下静置提取30 min,在10000×g、40 ℃下离心10 min,取上清液待用。

1.2.12.1 DPPH自由基清除能力测定 参照Miller等的方法并略作修改[6]。100 μL样品上清液加入到4 mL 0.14 mmol/L DPPH溶液中,常温避光条件下放置45 min后,在517 nm处测定吸光值。以100 μL甲醇加入到4 mL DPPH溶液为对照。

Trolox标准曲线的制作:甲醇配制Trolox标准溶液,分别取100 μL与4 mL DPPH溶液,常温避光反应45 min,于517 nm处测定吸光值。得到标准曲线,Y=0.797X+0.07(R2=0.997),结果用Trolox当量表示,单位为mmol/kg。

1.2.12.2 铁离子还原能力(Ferric reducing power,FRAP)测定 参照Aljadi等的方法并略做修改[7]。取100 μL上清液加入到4 mL TPTZ工作液(pH3.6的醋酸盐缓冲液,10 mmol/L的TPTZ工作液,20 mmol/L的FeCl3按体积比10∶1∶1配制)中于37 ℃反应10 min,测定在593 nm处的吸光值。每个样品重复测定3次。

Trolox标准曲线的制作:甲醇配制Trolox标准溶液,分别取100 μL与4 mL TPTZ工作液在37 ℃避光反应10 min,于593 nm处测吸光值,得到标准曲线,Y=1.159X-0.006(R2=0.995),结果用Trolox当量表示,单位为mmol/kg。

1.2.13 酶活性测定 将5 g样品与30 g提取液(0.2 mol/L,pH=6.5磷酸缓冲液配制的40 g/L的PVPP溶液)混合均匀,在4 ℃下静置1 h后,10000×g,4 ℃离心10 min,过滤取上清液粗酶液。

1.2.13.1 多酚氧化酶活性(polyphenol oxidase,PPO)的测定 采用分光光度法,在2 mL的0.07 mol/L的邻苯二酚溶液中加入1 mL粗酶液,立即在420 nm处测定吸光值,测定时间为5 min,曲线拐点处的斜率即为酶活。

1.2.13.2 果胶甲酯酶(Pectin Methylesterase,PME)酶活性的测定 于(30±2) ℃循环水浴的烧杯中放入60 mL果胶溶液,滴加0.03 mol/L的NaOH使果胶pH达到7.0,此时加入5 mL的粗酶液,继续滴加NaOH使pH维持在7.5。记录加入粗酶液后的30 min内滴加NaOH的量。

1.2.14 流变测定 参照Jasim的方法,并略作修改[8]。样品在室温下平衡30 min之后,使用AR1000型流变仪进行测定,选择40 mm直径的珀尔帖铝板,设置间隙1 mm,将2 mL样品置于加样台,擦去多余样品,平衡2 min后在25 ℃下进行测定。

1.2.14.1 静态流变性质测定 设置剪切速率从0.1 s上升到100 s,记录剪切应力和黏度随剪切速率的变化情况。

1.2.14.2 动态流变性质测定 进行振荡-振幅扫描,固定角频率5 rad/s,应力振幅从0.01 Pa增加到5 Pa,找到线性粘弹区间。在线性粘弹区间内,固定应力振幅为1.5 Pa,震荡角频率变化范围为0.1～10 rad/s,测定样品的储能模量(G′)和损耗模量(G″)随震荡角频率变化的变化趋势。

1.2.15 粒度测定 使用Ls230激光粒度分析仪测定样品的粒度分布。通750 nm长的激光衍射,通过测量样品颗粒的散射光强度及散射角的大小,得出粒径为0.4～2000.0 μm的颗粒分布。记录样品的粒度分布、体积平均粒径(d43)和表面积平均粒径(d32)。

1.3 数据处理

试验结果以均值±标准误差(Mean±SE)表示。为了保证实验结果的可靠性所有试验均进行3次重复。应用SPSS 20统计软件,对数据进行方差分析,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同配比对复合苹果泥感官评价的影响

复合苹果泥制备好后立即请10名感官评价员进行感官评价,结果如表2所示。预试验对配比已经进行大范围筛选,所以表中不同配比对复合苹果泥的风味、口感、组织状态和总分影响不显著(P>0.05)。当苹果∶猕猴桃∶胡萝卜的比例为6∶2∶1时,其各项指标的评分都较高且总分最高。综合考虑感官评价结果,选择6∶2∶1为最佳配比进行后续试验。

表2 不同配比的复合苹果泥感官评价结果(分)

2.2 不同超高压条件的杀菌效果

未处理样品菌落总数为4.04 lg CFU/g,霉菌和酵母数量为3.16 lg CFU/g。表3表明400和500 MPa分别处理2、5、8、10 min均未检出微生物,说明超高压处理能有效杀灭复合苹果泥中的微生物。文献也表明一般的腐败菌和病原菌在200～600 MPa的压力下即可灭活[9]。室温下300 MPa/2 min的超高压条件能有效杀灭草莓酱中4.3 lg CFU/g的天然酵母和霉菌[10]。马婧的研究中也发现400 MPa/15 min能杀灭猕猴桃汁中2.74 lg CFU/mL的菌落总数[11]。因此考虑实际生产效率,最终选择处理时间短的400 MPa/2 min和500 MPa/2 min进行后续试验研究。

表3 不同处理对复合苹果泥中菌落总数以及霉菌和酵母数量的影响

2.3 超高压处理对复合苹果泥的pH、TSS和颜色的影响

表4是不同处理对复合苹果泥pH、TSS和颜色的影响。未处理复合苹果泥pH3.98,偏酸性,热处理后基本无变化,超高压则使pH显著降低(P<0.05),可能是超高压导致细胞膜破裂、有机酸流出,使总酸含量上升、pH下降[12]。热处理和超高压复合苹果泥的TSS之间没有显著性差异(P>0.05)。Picouet等在酸化的胡萝卜汁中也得出同样结论[13]。热处理和超高压复合苹果泥的L*、a*、b*值与未处理之间都没有显著性差异(P>0.05),但超高压样品的ΔE更小,颜色与未处理更接近。Huang等[10]也报道过250和300 MPa超高压处理的草莓酱与对照组的L*、a*、b*均无显著性差异(P>0.05),与本试验结果一致。

表4 不同处理对复合苹果泥的pH、TSS和颜色的影响

2.4 超高压处理对复合苹果泥膳食纤维含量的影响

图1为不同处理后复合苹果泥膳食纤维含量图,热处理、400 MPa/2 min和500 MPa/2 min的超高压处理使复合苹果泥膳食纤维含量由1.40 g/100 g降至1.28、1.24、1.20 g/100 g,不同处理方式间没有显著性差异(P>0.05)。在胡晓平等[14]的研究中发现经过60 ℃、300 MPa/40 min的最佳超高压处理,辣椒总膳食纤维含量变化与实验中结果类似。Yan等也提到超高压处理后不可溶性膳食纤维含量减小,并推测原因可能是超高压处理引起的纤维细胞和细胞膜内部结构的改变,以及不溶性纤维素和半纤维素转化为可溶性膳食纤维所致[15]。

图1 不同处理对复合苹果泥膳食纤维含量的影响

2.5 超高压处理对复合苹果泥总酚、抗坏血酸、类胡萝卜素含量的影响

图2为不同处理对复合苹果泥总酚、抗坏血酸含量的影响。热处理、400 MPa/2 min和500 MPa/2 min处理的复合苹果泥的总酚含量由150.67 mg/100 g降至123.05、105.26和104.89 mg/100 g。在高歌[16]的试验中证实马家柚经450 MPa/15 min和550 MPa/10 min的超高压处理总酚含量下降,同时提出酚类物质的含量下降可能与PPO酶活有关。图4A表明热处理和超高压处理未完全钝化PPO酶,但热处理钝化酶活效果更好,这可能是热处理总酚含量更高的原因。

图2 不同处理对复合苹果泥总酚、抗坏血酸含量的影响

图4 不同处理对复合苹果泥PPO(A)和PME(B)酶活性的影响

超高压处理可以更好地保留样品中的抗坏血酸,含量在0.75～0.83 mg/100 g,而热处理复合苹果泥仅残余0.55 mg/100 g的抗坏血酸。抗坏血酸是热敏性物质,在高温下容易降解,超高压过程温度低,所以抗坏血酸等营养物质得以保留[17]。王凌云[18]发现200～500 MPa处理不会降低超高压猕猴桃产品抗坏血酸的保留率。

表5为不同处理对复合苹果泥类胡萝卜素含量的影响。超高压与热处理均没有对样品中的总类胡萝卜素和β-胡萝卜素产生显著性影响(P>0.05)。Jennifer等[19]也发现400 MPa/2 min和600 MPa/2 min超高压处理对胡萝卜、青豆和西蓝花的类胡萝卜素含量和β-胡萝卜素含量没有显著性影响(P>0.05)。

表5 不同处理对复合苹果泥类胡萝卜素含量的影响

2.6 超高压对复合苹果泥抗氧化能力的影响

图3为不同处理后复合苹果泥清除DPPH自由基能力和FRAP铁还原能力。热处理显著降低了复合苹果泥清除DPPH自由基能力(P<0.05),而超高压处理与未处理之间没有显著性差异(P>0.05)。热处理复合苹果泥FRAP铁还原能力显著下降(P<0.05),由0.91 mmol/kg降低为0.83 mmol/kg,而400 MPa/2 min和500 MPa/2 min超高压处理的复合苹果泥FRAP铁还原能力与未处理没有显著性差异(P>0.05),分别保持在0.89和0.94 mmol/kg。结果表明,超高压处理的复合苹果泥具有更好的抗氧化能力。Rocío等对柑橘的超高压试验、Shen等对枣浆的超高压试验也证明超高压处理对样品清除DPPH自由基能力没有显著影响(P>0.05)[20-21]。Paciulli等[22]发现650 MPa处理3、7、15、30 min的甜菜根的FRAP铁还原能力与未处理之间没有显著性差异(P>0.05),与本试验结果一致。

图3 不同处理对复合苹果泥抗氧化能力的影响

抗氧化能力可能与类胡萝卜素和酚类物质的含量有关[23]。图2B表明超高压样品的抗坏血酸含量显著高于热处理样品(P<0.05),这可能是超高压样品具有更高抗氧化能力的原因。

2.7 超高压对复合苹果泥PPO和PME酶活性的影响

图4A是不同处理对复合苹果泥PPO酶活性的影响,热处理后PPO的酶活性降低至38.04%,400 MPa/2 min和500 MPa/2 min的超高压处理后分别降低为64.54%、56.70%。热处理对PPO酶活的钝化效果明显,同时超高压的压力越大对PPO酶活性的钝化效果越好。Krystian等[24]也有一致结论,在200 MPa/5 min的条件下残存的蘑菇PPO酶活性为80.4%,当压力升至400 MPa时,酶活仅为61.90%。

虽然超高压对PPO酶活性钝化的机制尚未完全确定,但潜在的机制表明,分子内相互作用、带电基团的水合作用、结合水的破坏和氢键的稳定化都是影响酶活的重要因素[25]。

图4B表示不同处理对样品PME酶活性的影响,热处理、400 MPa/2 min和500 MPa/2 min的超高压处理使PME酶活性分别降低至81.89%、86.91%、82.08%,没有显著性差异(P>0.05)。热处理和超高压都不能很好钝化PME酶活性,仍存在较高的残余活性,推测可能与胡萝卜基质的保护作用有关[26]。Jolie等[27]认为热处理和超高压处理都可能导致 PME 聚合物的形成,使PME产生较强的抗性,降低处理效果。Fernandez等[28]也发现630 MPa/6 min超高压处理只能降低27.10%的PME酶活性。

2.8 超高压处理对复合苹果泥流变特性的影响

2.8.1 静态流变 图5是不同处理方式对复合苹果泥静态流变特性的影响。随着剪切速率的增大,样品黏度随之下降,表现出剪切稀化,是典型的假塑性流体。超高压和热处理并未改变复合苹果泥的流体类型,但热处理后黏度下降,而超高压处理使复合苹果泥黏度增大。热处理使黏度降低可能是升温的过程分子无规则运动加剧,分子间距的增大使复合苹果泥内部形成更多的自由体积,从而链段易于活动,导致复合苹果泥的黏度降低[29]。而超高压处理使黏度增大可能是因为未完全钝化的PME酶使原果胶脱去甲氧基,在低pH下与钙离子结合产生凝胶,使黏度上升[26]。程怡然等[30]的研究也发现400、500 MPa的超高压作用下番茄酱的黏度会增大,并且压力越大黏度越大。同样的结论在陈奕文研究的红枣复合果肉饮料中也有报道[31]。同时由图7和表6可以发现超高压和热处理都会减小复合苹果泥的粒径使得表面积增大,因此颗粒之间更容易聚集使黏度增大。

图7 不同处理对复合苹果泥粒径分布的影响

表6 不同处理对复合苹果泥d43和d32的影响

图5 不同处理对复合苹果泥黏度的影响

2.8.2 动态流变 图6为不同处理对复合苹果泥动粘弹性的影响,G′代表储能模量,与复合苹果泥的弹性相关;G″为损耗能量,与样品的黏性有关。复合苹果泥的G′大于G″,体系表现为凝胶态。

图6 不同处理对复合苹果泥动粘弹性的影响

超高压和热处理未改变复合苹果泥的凝胶态,对比超高压和热处理的样品可以发现超高压处理的复合苹果泥样品的G′和G″增大更多。G′的增大主要是因为复合苹果泥粒径减小使颗粒聚集,此时对复合苹果泥颗粒施加外力会产生轻微形变而更有弹性[32]。G″的增大主要与黏度增大有关。程怡然[30]也提到400～500 MPa超高压处理的番茄酱动粘弹性显著大于热处理和对照组(P<0.05),说明超高压处理样品具有更好的粘弹性。

2.9 超高压对复合苹果泥粒度分布的影响

图7是不同处理对复合苹果泥粒径分布的影响图,表6是对应的体积平均粒径(d43)及表面积平均粒径(d32)变化情况。图7表明不同的处理方式都减小了复合苹果泥在1000 μm以上的体积比,同时在200 μm处出现新的峰,说明超高压和热处理都显著减小了复合苹果泥的粒径(P<0.05),这一结论也在表6中得到证实。粒径的减小可能与未钝化的PME酶活性有关,PME酶使复合苹果泥细胞结构遭破坏,颗粒减小。而对比400 MPa/2 min和500 MPa/2 min的超高压处理发现，粒径随着压力的增大而增大,这可能是因为压力的升高造成自由粒子数减小,使复合苹果泥中的蛋白和果胶凝聚使粒径增大[26]。方亮[33]对猕猴桃果汁的研究中也有相同结论,当压力由200 MPa升至400 MPa,处理时间保持15 min,样品的粒径由513.6 nm增大到541.6 nm。

3 结论

复合果蔬产品的市场需求越来越大,为了满足老人、儿童等特殊人群的营养需求,需要果蔬泥产品更具有个性化和多元性的特点。本文通过感官评价筛选出复合苹果泥的最佳配方,并发现超高压处理能明显降低复合苹果泥中微生物的数量,且400 MPa/2 min、500 MPa/2 min的超高压处理就能达到国家对果蔬产品微生物标准的要求。与热处理相比,超高压处理能够更好地保持样品的色泽、抗坏血酸含量、抗氧化能力以及流变特性,但超高压处理对PPO和PME酶活性的钝化效果较差,因此可以考虑将低强度热烫预处理和超高压处理相结合,实现钝化内源酶、保证品质稳定的目的。此外,还需要对贮藏期间超高压复合苹果泥微生物及品质变化进行研究,得到相应变化规律,从而确定产品货架期。