提取溶剂对石榴籽油生物活性及纳米乳形成的影响

杨 萍,申元福,鄢 硕,李小红,姚 倩,*

(1.成都大学药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室,四川成都 610106;2.成都大学药学与生物工程学院,四川成都 610106;3.四川科伦药业股份有限公司,四川成都 610500;4.成都大学医学院,四川成都 610106)

石榴为石榴科石榴属植物,原产于中亚,在我国亚热带及温带地区均有分布。石榴籽含油量可高达20%[1]。以前人们对石榴籽的认识不足,很少加以利用。近年来研究发现石榴籽油(pomegranate seed oil,PSO)具有抗氧化、抗癌、降血糖、提高机体免疫、抗菌等多种药理作用[2-5],有极大的利用价值。

自纳米乳化系统(self-nanoemulsifying system,SNES)是近年发展起来的一种新型给药系统,由油、乳化剂和助乳化剂组成,经水或消化液稀释后能自发形成粒径在100 nm以下的纳米乳[6]。由于纳米乳分散度高,与小肠黏膜的接触面积大,可显著提高难溶组分的溶解度和口服生物利用度,被广泛应用于药品和食品领域[7-9]。PSO作为油相用于微乳或纳米乳的制备,不仅能增加配伍组分的溶解度,且由于PSO的多种生物活性,还能对配伍组分产生协同增效作用,增强传递体系的整体治疗效果[10]。

PSO主要含多酚、黄酮及石榴酸等有效成分,提取溶剂对有效成分含量影响较大,最终引起其药理作用的差异。SNES是PSO极有前途的一种制剂应用形式,PSO SNES所形成的纳米乳粒径大小与其吸收及药效发挥直接相关。目前对PSO提取工艺的研究大多仅以出油率作为考察指标,而未考虑提取溶剂对PSO有效成分和生物活性以及后续药用制剂形式(纳米乳)制备等的可能影响。因此,本实验以PSO出油率、有效成分含量、抗氧化活性、PSO SNES制成的纳米乳浊度及抗菌活性为指标,系统研究提取溶剂对PSO有效成分、生物活性与纳米乳成型性的潜在作用规律,为PSO的质量提升及相关产品开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴籽 安徽亳州盛源药材有限公司;酵母菌 成都大学药学与生物工程学院生物基础实验室保存菌种;2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS) 南京奥多福尼生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;芦丁(含量大于99.0%) 中国药品生物制品检定所;正癸酸甲酯(含量大于99.0%) 上海麦克林生化科技有限公司;石榴酸甲酯(经GC面积归一化分析含量大于95%) 实验室自制;乙酸乙酯、正己烷、石油醚(沸程60～90 ℃)、二氯甲烷、环己烷 均为分析纯,成都科龙化工试剂厂。

KQ-400KDE型高功率数控超声仪 昆山市超声仪器有限公司;5100B型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;RE-5203 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DPH 060恒温培养箱 上海实验仪器厂有限公司;SHZ-B水浴恒温振荡器 上海博讯实业有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 成都康宇科技有限公司;7890B气相色谱仪 安捷伦公司;乌氏毛细管粘度计 上海申谊玻璃制品有限公司;Zetasizer Nano ZSP激光粒度测定仪 英国马尔文公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PSO的提取 取石榴籽,粉碎,过80目筛,称取一定量的粉末,按1∶10的比例加入提取溶剂,在40 ℃下以400 W功率超声提取35 min,抽滤,40 ℃下旋转蒸发除去有机溶剂,得PSO[11]。

提取溶剂分别选择乙酸乙酯、二氯甲烷、环己烷、正己烷及石油醚5种有机溶剂。测定不同有机溶剂提取的PSO的理化常数、抗氧化活性,制备PSO SNES,并稀释为纳米乳,测定纳米乳浊度及PSO SNES抗酵母菌活性,以确定最佳提取溶剂。

1.2.2 PSO SNES的制备 分别以5种有机溶剂提取的PSO为油相,聚氧乙烯蓖麻油为乳化剂,聚乙二醇400为助乳化剂制备PSO SNES。取聚氧乙烯蓖麻油、聚乙二醇400和PSO,按4∶4∶1比例旋涡混匀,以400 W功率超声8 min除去气泡,即得PSO SNES[10]。

1.2.3 理化指标

1.2.3.1 出油率 以PSO与石榴籽质量比计算出油率[12]。

1.2.3.2 粘度 采用乌氏粘度仪测定35 ℃下PSO的相对粘度[13]。

1.2.3.3 酸值、碘值和皂化值 酸值采用热乙醇滴定法[14],碘值采用中和滴定法[15],皂化值采用中和滴定法[16]。

1.2.3.4 总黄酮含量 PSO样品中总黄酮含量的测定参照NaNO2-Al(NO3)3法进行[17]。

a.芦丁标准曲线绘制:芦丁在0.025～0.800 mg/mL浓度范围内的标准曲线回归方程为:Y=0.7746X+0.0043;相关系数为0.9999,吸光度与芦丁浓度呈良好线性关系。

b.样品测定:准确吸取PSO 0.25 mL于离心管中,加入1 mL乙醇-水(5∶1)溶液,于旋涡混合仪上旋涡提取5 min,10000 r/min下离心10 min,收集上清液,重复提取3次,合并提取液,即得样品供试液。在506 nm波长处测定样品供试液吸光度值,利用芦丁标准曲线计算出样品中总黄酮的含量,以每毫升油芦丁当量(mg/mL)表示。

1.2.3.5 总多酚含量 PSO样品中总多酚含量的测定参照Folin-Ciocalteu法进行[18]。

a.没食子酸标准曲线的绘制:没食子酸在5～160 μg/mL浓度范围内的标准曲线回归方程为:Y=0.0077X+0.0351;相关系数为0.9991,吸光度与没食子酸浓度呈良好线性关系。

b.样品测定:精确移取石榴籽油0.25 mL于离心管中,加入80%乙醇溶液0.5 mL,于旋涡振荡仪上旋涡提取5 min,10000 r/min下离心10 min,收集上清液,重复提取3次,合并提取液,即得样品供试液。取样品供试液,在765 nm波长处测定吸光度值,根据没食子酸回归方程计算出样品中总多酚的含量,以每毫升油没食子酸当量(μg/mL)表示。

1.2.3.6 石榴酸含量 a.气相色谱分析条件[19]:色谱柱为HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm),载气为高纯氮气,柱流量1.2 mL/min,进样口分流比20∶1,进样口温度270 ℃,进样量为1 μL,FID温度为310 ℃。毛细管柱程序升温:90 ℃开始,保持3 min,以15 ℃/min升温至180 ℃,保持10 min,再以2.5 ℃/min升温至250 ℃。

b.石榴酸甲酯标准曲线的绘制:石榴酸甲酯在235.63～3770 μg/mL浓度范围内的标准曲线回归方程为:Y=0.0018X+0.0738;相关系数为0.9999,石榴酸甲酯与内标癸酸甲酯峰面积比值与浓度呈良好线性关系。

c.样品测定:取PSO 15 mg于具塞试管中,加入0.5 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液4 mL,70 ℃水浴反应5 min,冷却至室温后加入适量浓盐酸调pH至4～5,加入15 mg/mL癸酸甲酯内标溶液0.1 mL,用正己烷漩涡提取3次,每次2 mL,合并3次提取液,经过滤后进行GC分析,根据标准曲线计算每毫克油中石榴酸含量。

1.2.4 抗氧化指标

1.2.4.1 DPPH·清除率 经预试验确定PSO样品在测试浓度下背景无吸收(1.2.4.2同),分别量取不同体积PSO及VE油,置试管中,加入200 μL异丙醇使油溶解,用无水乙醇稀释至1 mL,混匀;加入DPPH·溶液2 mL,混匀,室温暗处放置30 min,于517 nm处测定吸光度A1[20]。以无水乙醇代替油,同法操作,测定吸光度A0。按下式计算清除率:

1.2.5 纳米乳浊度的测定 将PSO SNES经5倍水稀释,在500 nm波长处测定浊度值。

1.2.6 PSO SNES抗酵母菌活性测定 经预实验确定PSO SNES样品在测试浓度下对检测无影响[22]。采用50%酵母浸出粉胨葡萄糖培养基培养酵母菌,其中含琼脂0.2%。将酵母菌稀释成密度为104CFU/mL的菌液,分别取3 mL,置于具塞试管中,分别加入0.025～1.6 mL的PSO SNES,用培养基稀释至5 mL,混匀;以水代替PSO SNES,同法操作,作为空白对照组。取样品液与空白对照液,在600 nm波长处测定初始浊度值;将其放入培养箱,在37 ℃下150 r/min摇床培养8 h,取出,加入84消毒液0.5 mL,混匀,室温放置30 min后,测定浊度值;计算培养前后浊度增加度,按下式计算抑菌率[22]:

式中:ΔA0:空白对照组菌液浊度增加值;ΔA1:PSO SNES组菌液浊度增加值。

1.2.7 相关性分析 采用SPSS 18.0软件分别对数据标准化后,分析PSO抗氧化活性、PSO SNES形成的纳米乳浊度及抗菌活性与各理化常数之间的相关性,探索PSO有效成分含量、理化性质对其活性及纳米乳形成的影响规律。

1.2.8 主成分分析筛选提取溶剂 选择PSO多酚、黄酮及石榴酸含量为有效成分指标,出油率为产量指标,自由基半数清除浓度(concentration at 50% clearance rate,CL50)为抗氧化活性指标,PSO SNES形成的纳米乳浊度为纳米乳粒径指标,PSO SNES对酵母菌的半数抑菌浓度(concentration at 50% inhibitory rate,IC50)为抗菌活性指标,采用SPSS18.0软件经过降维处理后,进行主成分分析。为使评分与各指标呈正相关,即指标值越大,评分越高,抗氧化、抗菌活性及纳米乳大小分别以1/CL50、1/IC50及浊度的倒数表示。

1.3 数据统计分析

各组数据均为3次平行试验的平均值(Mean)±标准偏差(SD),采用SPSS 18.0软件对数据进行ANOVA统计学分析和Duncan单因素多重比较分析,当P<0.05时,表明数据之间具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 PSO理化性质

用激光粒度测定仪测定了PSO(石油醚)作油相制备的PSO SNES经5倍水稀释后形成的纳米乳粒径,为(27.22±2.02) nm,表明PSO SNES有较好的自纳米乳化能力。研究显示,纳米乳浊度与粒径呈显著正相关[23],本实验采用浊度法考察提取溶剂对PSO纳米乳粒径的影响。PSO经5种不同有机溶剂提取后的出油率、理化性质、相关含量测定结果及制备的纳米乳浊度见表1。由表1可知,不同提取溶剂对PSO粘度、酸值、黄酮、多酚、石榴酸含量及纳米乳浊度有很大影响。二氯甲烷制备的PSO粘度最高,石油醚最低;乙酸乙酯所得PSO多酚含量最高,且其纳米乳浊度最低;石油醚所得PSO石榴酸含量最高。

表1 PSO的出油率、理化性质、有效成分及纳米乳浊度

2.2 PSO抗氧化活性

不同提取溶剂所得PSO对DPPH·及ABTS+·清除率见图1。由图1可知,溶剂对两种自由基的影响趋势基本相似。以油浓度为0.2%(v/v)时的清除率做统计学分析,显示抗氧化顺序为乙酸乙酯、二氯甲烷>环己烷、正己烷、石油醚>VE(P<0.05),表明虽然不同溶剂提取的PSO抗氧化活性存在差异,但均显著高于阳性对照VE(P<0.05);5种溶剂中,乙酸乙酯或二氯甲烷所得PSO(体积分数0.4%除外)对自由基的清除能力显著强于其他三种溶剂(P<0.05),三种溶剂间无明显差异(P>0.05)。

图1 提取溶剂对PSO的DPPH·(A)及ABTS+·(B)清除率的影响

2.3 PSO SNES 抗酵母菌活性

前期研究中发现PSO SNES对革兰氏阳性菌抗菌活性不佳,对革兰氏阴性菌有较强抗菌作用,但不同有机溶剂制得的PSO SNES抗阴性菌活性差异不明显,因此本文仅探讨了PSO SNES对真菌酵母菌的抗菌作用。不同溶剂所得PSO SNES对酵母菌的抑制作用见图2。可见,各PSO SNES在低浓度时对酵母菌抑菌率相差相对较大,浓度为8%(v/v)时抑菌率顺序为乙酸乙酯、石油醚>正己烷>环己烷、二氯甲烷(P<0.05);随着浓度的增高,抑菌率逐渐增大,浓度达32%时抑菌率趋于一致。

图2 提取溶剂对PSO SNES抗酵母菌活性的影响

2.4 与理化常数的相关性

相关性分析结果分别见表2～表4。由表2～表4可知,PSO抗氧化活性主要与多酚含量与皂化值呈显著正相关(P<0.05),皂化值与多酚含量越高,油的抗氧化活性越强。

表4 PSO SNES抗酵母菌活性与PSO理化常数的相关性分析

表2 PSO抗氧化活性与理化常数的相关性分析

PSO SNES制出的纳米乳浊度受皂化值的影响较大,皂化值大的PSO不仅抗氧化活性强，还可制备出浊度低、粒径小的纳米乳。可能的原因为:皂化值为油中酯及游离脂肪酸含量的总和,在酸值相当的情况下,油酯含量越高,皂化值越大。PSO中的酯多以甘油酯和磷脂的形式存在[24],磷脂属于两性离子型表面活性剂,其含量高不仅能改善油与自由基的亲和作用,同时有助于纳米乳的形成。甘油酯包括甘油一、二及三酯,其中甘油一酯和二酯分别含有两个和一个游离的羟基,增大了油的亲水性,使其能具有适宜的亲水亲油平衡值,改善PSO与自由基的相互作用,增强油对自由基的清除能力。油亲水性的提高还利于与纳米乳处方中的乳化剂及助乳化剂相结合,形成粒径小的纳米乳。

PSO SNES抗酵母菌活性与PSO的理化常数及有效成分含量均无明显关联。究其原因,纳米乳的抗菌活性可能取决于所用油相、乳化剂及助乳化剂的协同作用,最终使细菌的细胞膜破裂[25],与单一某种因素的关系不密切。

表3 PSO SNES浊度与PSO理化常数的相关性分析

2.5 主成分分析筛选提取溶剂

因PSO清除DPPH与ABTS+自由基的趋势基本相似,实验仅选择了DPPH自由基的1/CL50作为抗氧化活性指标进行主成分分析。主成分分析的目的是通过降维作用将多个因子变量转化成少数综合性变量,利用少数的指标来反映整体的信息。因此将出油率、有效成分(多酚、黄酮、石榴酸)含量、浊度倒数、抗氧化活性、抗酵母菌活性7个指标进行主成分分析。采用SPSS18.0软件将7个指标降维为3个主成分,主成分对方差累积贡献率为93.047%,表明3个主成分可以有效地反应原始变量的绝大部分信息,达到降维目的,从而能够综合评价提取溶剂对PSO生物活性及纳米乳形成的影响。各指标对主成分的载荷图见图3。由图3可知,主成分1主要代表了黄酮、多酚、石榴酸含量、抗氧化活性及纳米乳浊度5个指标,载荷系数在0.77以上;主成分2及主成分3分别主要与出油率和纳米乳抗酵母菌活性相关,载荷系数在0.81以上。

图3 主成分载荷图

为了综合评价提取溶剂对PSO生物活性及纳米乳形成的影响,根据标准化的各指标与因子载荷矩阵计算各提取溶剂得分及各指标权重,公式如下:

其中,H为提取溶剂总分,A、B、C分别为主成分1、2及3特征值的平方根,FAC1、FAC2及FAC3为软件计算出的各主成分因子值,V1、V2及V3分别为主成分1、2及3的方差贡献率;Wi为第i个指标的权重,L1i、L2i、L3i分别为第i个指标在主成分1、2及3的载荷系数,n为主成分分析的指标(本实验n=7)。

乙酸乙酯、二氯甲烷、环己烷、正己烷及石油醚的计算总分分别为1.46、-0.03、-0.66、-1.44和0.68,乙酸乙酯得分最高,其次为石油醚,正己烷得分最低。说明以乙酸乙酯为提取溶剂,制得的PSO有效成分含量与生物活性综合评分为最佳。权重大的指标对综合得分影响较大,各指标权重计算结果见表5。由表5可知,权重大于0.12的指标由高至低依次为出油率、石榴酸含量、抗酵母菌活性和多酚含量。由于各提取溶剂提取的PSO出油率相差不大,因此提取溶剂在这项指标上得分亦相差不大;在其余几项权重较高的指标中,乙酸乙酯提取的PSO抗酵母菌活性与多酚含量为最高,其石榴酸含量仅次于石油醚,与二氯甲烷近似,故乙酸乙酯的总分最高。由于多酚类物质带有多个羟基,极性较大,而在5种有机溶剂中,乙酸乙酯的极性相对较大,使得PSO(乙酸乙酯)多酚含量远高于其他几种溶剂;石榴酸在PSO中以酯的形式存在,乙酸乙酯作为酯类溶剂,对石榴酸酯也表现出了优异的提取率。

表5 各指标权重

3 结论

不同提取溶剂对PSO的有效成分含量及纳米乳的形成有很大影响;PSO抗氧化活性与PSO多酚含量及皂化值呈显著正相关(r>0.9,P<0.05),PSO SNES形成的纳米乳浊度与油的皂化值为负相关(r=-0.798),即皂化值越大,纳米乳粒径越小。以油的出油率、有效成分含量、抗氧化活性、PSO SNES形成的纳米乳浊度及PSO SNES的抗酵母菌活性为指标进行主成分分析与评分,乙酸乙酯、二氯甲烷、环己烷、正己烷及石油醚的得分分别为1.46、-0.03、-0.66、-1.44和0.68,乙酸乙酯综合评分为最高,其次为石油醚。后续实验可就提取溶剂对油的抗癌、降脂及降糖等活性的影响开展相关工作。