基于COSMORS方法筛选低共熔溶剂及银杏叶类黄酮提取工艺优化

姚金昊,刘芝涵,李春露,吴倩文,翟子琦,李 翔,崔志芳

(山东科技大学化学与生物工程学院,山东青岛 266590)

黄酮类化合物是银杏叶中主要成分之一(含量可达6%～8%),生理活性和药理活性十分广泛[1]。该类化合物通过抗氧化和去除氧自由基而具有抗衰老的功效[2-3],还可增强机体免疫力,具有抗炎、抗病毒等功能[4]。

银杏叶中类黄酮常采用一定体积分数的乙醇等极性有机溶剂加以提取[5]。近年来有学者采用超声或微波来加速黄酮类成分溶出,进而缩短提取时间[6-7],但提取时仍然多采用易燃易爆、易挥发的有机溶剂。采用超临界流体CO2从银杏叶中提取得到类黄酮[8],但需要高额的设备投资以及维护费用,成为制约该技术得到实际应用的一大瓶颈。所以,寻找易于制备、经济且更为绿色的新型提取溶剂,并对提取工艺进行优化,对于该资源的有效开发利用具有十分重要的意义。

天然低共熔溶剂(Natural Deep Eutectic Solvents,NADESs)是由氢键受体(Hydrogen Bond Acceptor,HBA,常见的有季铵盐)与氢键供体(Hydrogen Bond Donor,HBD)按照一定摩尔配比所组成的一类新型溶剂,其凝固点显著低于各个纯组分的熔点[9]。HBA与HBD均为天然衍生物,具有无蒸汽压、无毒可降解、易于制备成本低等优点,在萃取分离、有机合成等领域有广泛的应用前景[10-12]。无论是小分子的肉桂酸、紫杉醇,亦或是大分子木质素等,都能在合适的NADESs体系中有很好的溶解度[13-14]。Wei等[15]采用NADESs氯化胆碱/乙二醇萃取木豆叶中的酚类物质,Dai等[16]使用不同的NADESs对长春花中的花青素进行提取,结果发现其得率大大高于传统溶剂,说明NADESs在天然产物萃取分离方面具有较大开发潜力。

因不同NADESs对类黄酮的溶解能力差别很大,如通过实验逐一筛选,所需实验工作量很大[17],若能利用相关软件对不同NADESs溶解类黄酮能力进行模拟计算筛选,再对较优的NADESs进行实验验证,则可极大节省实验过程中人力及时间、资金投入。真实溶剂类导体屏蔽模型(Conductor-like Screening Model for Real Solvents,COSMO-RS)基于单分子量子力学计算与统计热力学方法相结合[18],用体系中分子结构等作为输入数据,来预测特定分子的热力学性质,计算出无限稀释活度系数γ,初步筛选哪些溶剂能对特定物质的溶解效果较好[19],该模型已帮助不同研究方向的团队找到适合不同产物提取的最佳溶剂[20-21]。

本研究采用模拟计算与实验相结合的方法,通过COSMO-RS计算,以γ为指标,从多组NADESs组合中筛选出提取类黄酮较优的NADESs。利用响应面法试验设计,对影响类黄酮提取的工艺条件如固液比、温度、提取时间等因素进行优化,得到最优的NADESs提取类黄酮工艺,并为天然产物的NADESs提取相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏叶 2018年秋季收集于山东科技大学校园(青岛),用流动自来水洗涤后自然晾干,粉碎机粉碎,过100目筛,105 ℃烘箱烘干后放于气密容器中备用;芦丁对照品 纯度91.7%,购于中国药品生物制品检定所;氯化胆碱 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;实验所用其它试剂 均为国产分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

WFJ 7200型可见分光光度计 优尼柯(上海)仪器有限公司;TGL-16M台式高速冷却离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 杭州市明远仪器有限公司;FA2004N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;计算模拟所用软件为Materials Studio7.0 美国Accelrys。

1.2 实验方法

1.2.1 COSMO-RS软件模拟计算筛选NADESs 计算所用NADESs:基于成本低廉、生物相容性好等方面考虑,选取氯化胆碱为HBA,尿素、甘油、乳酸、柠檬酸、丙二酸、草酸作为HBD,组成6类NADESs体系[7],每类溶剂体系下分别讨论3种HBA与HBD摩尔配比:2∶1、1∶1和1∶2(共18组NADESs)。

基于COSMO-RS模型的相关计算部分主要流程如图1所示。以芦丁作为模型溶质分子,并将每组NADESs作为提取所用溶剂,对芦丁这一溶质分子的γ值进行计算,γ值较低则意味着该溶剂体系对于芦丁的溶解能力较强[19]。选取γ值较低的NADESs进行后续类黄酮提取实验。

图1 基于COSMO-RS计算模拟筛选类黄酮提取所用NADESs流程图

1.2.2 NADESs的配制 将氯化胆碱为HBA,尿素、甘油、乳酸、柠檬酸、丙二酸、草酸为HBD所组成的6类NADESs,在保证HBA和HBD总质量为100 g的基础上,以HBA和HBD摩尔比例为2∶1、1∶1和1∶2分别称取相应量的HBA和HBD,置于500 mL的圆底烧瓶中,用橡胶塞密封后,置于70 ℃磁力搅拌水浴锅中搅拌,直至瓶内液体均相、无色透明液体时停止加热,取出圆底烧瓶逐渐冷却至室温,即得NADESs,将其作为提取溶剂提取银杏叶中的类黄酮。

1.2.3 NADESs提取类黄酮工艺流程 称取0.2 g(计为W g)银杏叶粉末,取一定体积NADESs(按料液比)加入20 mL钳口瓶中,将银杏叶粉末加入,放入磁力搅拌子后压盖密封,置于一定温度磁力搅拌水浴锅中搅拌提取一定时间。将其转移到离心管中,8000 r/min下离心25 min,上清液即为粗提液,记录粗提液体积V mL。

1.2.4 单因素实验 在模拟筛选的基础上对所得较优的NADESs——氯化胆碱/甘油(摩尔比1∶2)进行银杏叶类黄酮提取单因素实验,对影响类黄酮得率的主要因素如提取时间、提取温度、固液比进行单因素实验。采用80 ℃,固液比1∶30 (g/mL)的初始条件,本研究先考察时间(0.5、1、2、3、4、5、6、7 h)对类黄酮提取的影响,再在较优提取时间及固液比1∶30 (g/mL)的条件下研究提取温度(40、50、60、70、80、90 ℃)的影响,最后在较优提取时间、温度下研究固液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)对类黄酮提取的影响。

1.2.5 响应面试验 在单因素实验基础上,采用Box-Behnken试验设计原理,进行响应面试验设计[22],以类黄酮得率为主要考察指标,对于固液比、提取时间、提取温度三个因素进行优化。响应面试验的因素与水平如下表1所示。

表1 响应面试验的因素与水平表

1.2.6 指标计算

1.2.6.1 芦丁标准曲线测定 黄酮类化合物均以2-苯基色原酮为母核结构,具有相同的吸光特性,常用芦丁作为类黄酮标准品。具体测定方法在前人报道的基础上略作改进[23]:用NADESs配制0.25 mg/mL芦丁标准溶液。吸取一定量芦丁标准溶液,用NADESs补足到3.2 mL。依次加入显色剂5% NaNO2、10% Al(NO)3各1.4 mL,摇匀、静置,再加入4.0 mL 4% NaOH,摇匀放置15 min。3800 r/min离心10 min,空白试剂为3.2 mL NADESs,其余成分同测定管,用分光光度计在510 nm处测定各组吸光值并绘制标准曲线。所得标准曲线线性回归方程为y=9.5788x+0.0033,R2为0.9993。式中y为芦丁浓度(mg/mL),x为溶液的吸光度。

1.2.6.2 提取液中类黄酮含量测定及得率计算 吸取适量稀释后银杏叶类黄酮提取液,用NADESs补足至3.2 mL,其余操作与标准曲线测定步骤一样,采用下式计算类黄酮得率:

式(1)

式中:c -稀释后提取液中类黄酮浓度,mg/mL;n-稀释倍数;V - 所得提取液总体积,mL;W - 银杏叶质量,g。类黄酮含量测定每个样品测定三次,取平均值进行计算。

1.3 数据处理

所有的提取实验均平行重复3 次,每个提取液浓度测定时重复3次,单因素实验结果绘制采用Excel 2013,实验设计以及相关实验数据的回归分析、等高图以及三维图绘制均采用Design Expert9.0(StatEase Inc.,美国)。回归方程采用方差分析进行多重比较,拟合模型的判断通过方差分析中的F值检验,P<0.05 被认为有统计学意义,并结合失拟项确定。模型的拟合度和合理性则可通过回归系数R2以及校正决定系数等进行评判。

2 结果与分析

2.1 计算机模拟筛选NADESs

采用图1所示的COSMO-RS计算模拟流程图进行NADESs筛选,得到不同溶剂对于芦丁的无限稀释活度系数γ,发现以本研究所考察的三个HBA∶HBD配比下,摩尔比为1∶2时,所得NADESs最易配制、且γ相较其他摩尔比要小。

对于该摩尔比下的六组NADESs体系进行银杏叶类黄酮的初步提取实验,提取条件为80 ℃,2 h,固液比1∶30 (g/mL),所得不同体系下类黄酮得率如表2所示(同时列出该体系对芦丁的γ)。由表2可见,甘油做HBD时对应芦丁的γ最小,同时提取类黄酮得率也最高,表明计算所得γ与类黄酮得率有一定相关性。

表2 基于氯化胆碱的不同NADESs(HBA与HBD摩尔比1∶2)模拟计算及初步提取结果

因此后续的实验中采取摩尔比为1∶2的氯化胆碱/甘油所组成的NADESs,对于银杏叶中类黄酮进行提取工艺优化。

2.2 NADESs提取类黄酮单因素实验

根据1.2所述的流程和方法对类黄酮提取进行单因素实验,所得结果如图2所示。

图2 提取时间(A)、提取温度(B)和固液比(C)对银杏叶类黄酮得率的影响

由图2A可以看出:提取的前2 h,类黄酮得率随时间上升速率最快;在2～6 h之间则随着时间的延长,类黄酮得率呈缓慢上升趋势,提取时间为6 h时,得率可达4.18%,之后呈降低趋势,提取时间为5、6 h时,类黄酮得率基本持平，可达4.18%,之后呈降低趋势。结合上述提取率的变化趋势,同时考虑到提取时间过长会导致提取成本增加,后续响应面试验拟定提取时间如表1所示的2、4、6 h三个水平。李保同[1]以银杏叶为原料,采取纤维素酶50 ℃作用1 h,之后用70%乙醇溶剂采用微波辅助提取,累计微波时间2 min,类黄酮得率达到最高为3.96%。说明本研究所用NADESs较传统有机溶剂得率较高,但所需提取时间较长,这主要是NADESs相比较传统有机溶剂的粘度较高,因而达到传质平衡所需时间相对较长[9]。

温度升高可促进传质,在一定程度上提高生物活性物质从固体原料中的脱出并溶解扩散到提取溶剂中的速度。采取固液比1∶30 (g/mL),在较优的提取时间5 h的提取条件下,对不同提取温度的影响进行了研究。由图2B温度对得率影响可以看出,随温度增加,得率逐渐增加,但是90 ℃下的得率略低于80 ℃,从节省加热耗能以及类黄酮这一生物活性物质的稳定性保障两方面考虑,不建议后续实验中提取温度高于90 ℃。因50 ℃时所得NADESs较为粘稠，传质较慢,也在一定程度上限制了类黄酮的提取,故响应面试验拟定选取55、70、85 ℃三个水平的提取温度加以优化。

由图2C可以看出,当采取相同量的银杏叶进行提取时,随提取所用溶剂量的增加,得率升高,但固液比1∶35和1∶40 g/mL条件下,平均得率均为4.28%,从节省溶剂损耗的角度而言,后续响应面试验中最高液固比设定为1∶35 g/mL。其它两个水平分别为1∶25、1∶30 g/mL。

2.3 NADESs提取类黄酮响应面试验

在单因素实验的基础上,进行NADESs提取类黄酮响应面试验,所得实验结果如表3所示。

表3 NADESs提取类黄酮响应面试验结果

对实验数据进行方差分析,结果进行二次多元回归拟合,得到因变量类黄酮得率和自变量X(固液比A,提取时间B和提取温度C)之间的关系式如下:

得率(%)=3.21 +2.28A+0.094B+1.11C-0.0019AB-0.13AC-0.31BC-0.54A2-0.21B2-1.92C2

本实验所得回归模型方差分析如表4所示,方差分析表明,F值234.83且P<0.0001表明该模型具有极显著统计学意义,失拟项P值为0.1266>0.05,说明该模型与实验拟合程度差异并不显著,可认为无失拟因素存在,可用该回归方程对实验结果进行分析[24]。校正决定系数R2(Adj R-Squared)为0.9934和变异系数CV为 2.22%,进一步说明模型具有较好的拟合性和合理性,可用来对NADESs提取银杏叶中类黄酮的工艺进行初步分析和预测。预测校正决定系数(Pred R-Squared)为0.9650,与校正决定系数很接近,衡量有效信号与噪声的信噪比为42.752(大于4.0视为合理)。

表4 回归模型方差分析

自变量一次项C,二次项BC、B2和C2对结果影响极显著(P<0.01),提取温度、温度与提取时间的交互作用、提取时间的平方以及提取温度的平方,这几个因素均对类黄酮得率的影响极显著(P<0.01);而固液比与固液比的平方这两个因素对类黄酮得率的影响显著(P<0.05)。

对于响应面实验所得的实验结果进行绘图,得到各因素在不同水平下对于类黄酮得率的等高线(左)和三维图(右)如图3所示。固液比和提取时间的等高线(图3A)最接近圆形,说明两者交互作用最不显著,而提取时间与提取温度所得椭圆形最明显(图3E),说明两者之间交互作用较大,该结果与表4方差分析的显著性结果对应。

图3 固液比、提取时间、提取温度对于类黄酮得率的响应面实验结果

利用拟合模型对银杏叶中类黄酮的NADESs(氯化胆碱/甘油摩尔比1∶2)提取工艺进行优化,得到最优提取工艺为:固液比1∶30.7 (g/mL),73.2 ℃下提取4.1 h,模型预测类黄酮得率为5.70%。在预测最优提取工艺下进行验证实验(3次重复),类黄酮得率为5.68%,与模型预测结果仅相差0.02%,高于文献中以银杏叶为原料提取类黄酮的得率。欧阳娜娜等[25]采用一定浓度乙醇作为提取溶剂,分别采取微波法和超声波法辅助法进行优化,得到银杏叶中类黄酮得率分别为4.09%和3.68%。于文萃[7]采用正交实验对银杏叶中类黄酮的微波提取进行优化,在70%乙醇浓度下,通过微波辅助,类黄酮得率最高可达4.71%。以上所得类黄酮得率的数据比对可以看出,尽管不同产地、不同生长周期的银杏叶中,类黄酮含量可能存在差别,本研究所得银杏叶中类黄酮得率远高于采用传统有机溶剂提取所得的结果。

3 结论

采用COSMO-RS计算方法,通过量子力学模拟计算,筛选出银杏叶中类黄酮提取较优的NADESs。在此基础上结合响应面法实验设计,对影响类黄酮提取的工艺条件进行优化。结果表明:采用氯化胆碱/甘油(摩尔比1∶2)的NADESs、固液比1∶30.7 (g/mL)、73.2 ℃下提取4.1 h,类黄酮得率可达5.68%。本研究通过计算机模拟计算和实验相结合的方式,在节省人力、物力及时间投入的同时,得到一种绿色、高效、低成本的银杏叶类黄酮NADESs最优提取工艺,为银杏叶资源的有效利用提供参考。