米糠蛋白阿拉伯木聚糖接枝复合物制备及其功能性质研究

赵悦琳,田忠华,刘东旭,刘 畅,于 雷,*

(1.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118;2.长春高新技术产业开发区预防保健中心,吉林长春 130012)

米糠蛋白是稻谷精加工的副产物之一,汇集了稻谷中60%以上的营养成分。米糠蛋白可以应用在食品中强化其营养价值[1];其还具有低致敏性,可以应用于针对特殊人群的食品中[2-3];同时米糠蛋白也具有抗癌、抗疲劳等功能[4]。但由于米糠蛋白中二硫键和表面疏水性氨基酸含量过多,使其溶解性差,限制了米糠蛋白的应用前景[5]。因此迫切需要对米糠蛋白改性。采用化学改性法可以使米糠蛋白的某些肽链断裂,并产生新的官能团,从而改善米糠蛋白的功能性质。其中美拉德反应是化学改性中使用最为广泛的方法[6-8]。

美拉德反应不需要化学催化剂,加热条件下可以自发进行[9]。目前常用于美拉德反应接枝蛋白的多糖主要有葡聚糖[10-11]、壳聚糖[12-13]等。而以阿拉伯木聚糖接枝米糠蛋白的研究尚未见报道。阿拉伯木聚糖是植物细胞壁的主要成分,由β-(1→4)糖苷键连接的吡喃木糖单位的线性骨架组成[14]。糖基化产物由于引入阿拉伯木聚糖骨架中的羟基,既表现出糖类物质的亲水特性又具有蛋白质的大分子特性,可有效改善米糠蛋白质的溶解性、持水性、乳化性等。

因此,本研究用阿拉伯木聚糖通过美拉德反应接枝米糠蛋白,制备米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物,在单因素实验基础上,采用响应面分析法优化制备工艺,并将制得的米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物与米糠蛋白进行持水性、乳化性及乳化稳定性的比较研究,以期为米糠蛋白在食品中的应用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜米糠、玉米麸皮 吉林省万昌米业有限公司;邻苯二甲醛O Phthalic Aldehyde(OPA) 源叶生物有限公司;四硼酸钠(分析纯) 天津市大茂化学试剂厂;氢氧化钠(分析纯) 成都金山化学试剂有限公司。

BSA124S-CW电子分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;HW·SY21-K电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司;F5A低速自动平衡离心机 北京雷勃尔离心机有限公司;UWave微波-紫外-超声萃取仪 上海新仪微波化学科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠蛋白的制备 参考李帅斐碱提米糠蛋白方法有所改动[15]。取粉碎后的米糠粉20 g按照1∶9的料液比加入蒸馏水,搅拌均匀,调节pH为10。在50 ℃下提取90 min。然后在4000 r/min转速下离心20 min,得到上清液A。将上清液A调节pH至4.5。在4000 r/min离心20 min,弃去上清液。冻干沉淀,得到碱提米糠蛋白,粗蛋白含量为13.7%。

1.2.2 阿拉伯木聚糖的提取 本实验提取的是玉米麸皮中的阿拉伯木聚糖,参照Jiang等[16]碱提阿拉伯木聚糖的方法并有所改动。称取定量的玉米麸皮粉,并加入0.3 mol/L氢氧化钠溶液(含0.5% H2O2V/V),在萃取仪中以超声功率500 W温度70 ℃条件下萃取30 min,在4000 r/min转速下离心20 min,得到上清液,用1 mol/L盐酸调节pH至4.5,再次以相同条件离心上清液。用无水乙醇调节上清液浓度为65%。过夜沉淀,离心(4000 r/min,10 min)取沉淀部分,冷冻干燥,得到阿拉伯木聚糖粗提物。

1.2.3 米糠蛋白-阿拉伯木聚糖糖基化复合物的制备 称取一定量的米糠蛋白(精确到0.001)[17],用pH为7的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为1%的蛋白溶液,按照一定的糖/蛋白质量比加入阿拉伯木聚糖,用氢氧化钠溶液调节出有不同pH的溶液,磁力搅拌20 min使溶液混合均匀。密封后放入水浴锅中,在一定的接枝时间、一定的接枝温度下进行糖基化改性反应,反应一定时间后取出立即放入冰水混合物中冷却。4000 r/min离心15 min除去不溶物,将上清液于4 ℃蒸馏水中透析24 h,将所透析的溶液冷冻干燥成粉末备用。

1.2.4 单因素实验 以接枝度为指标,研究接枝溶液pH、接枝反应时间、阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比、接枝反应温度对接枝反应的影响。

1.2.4.1 接枝溶液pH对接枝反应的影响 分别选取pH8、9、10、11、12作为实验条件,其他条件固定为接枝反应时间50 min、糖-蛋白质量比2∶1、接枝反应温度50 ℃。研究溶液pH对接枝度的影响。

1.2.4.2 接枝反应时间对接枝反应的影响 分别选取接枝反应时间30、40、50、60、70、80 min作为实验条件,其他条件固定为pH10、糖-蛋白质量比2∶1、接枝反应温度50 ℃,研究反应时间对接枝度的影响。

1.2.4.3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比对接枝反应的影响 分别选取1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1作为阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比,其他条件固定为pH10、接枝反应时间50 min、接枝反应温度50 ℃。研究糖-蛋白质量比对接枝度的影响。

1.2.4.4 接枝反应温度对接枝反应的影响 分别选取接枝反应温度30、40、50、60、70、80 ℃作为实验条件,其他条件固定为pH10、接枝反应时间50 min、糖-蛋白质量比2∶1。研究反应温度对接枝度的影响。

1.2.5 响应面试验设计 在单因素实验的基础上,采用四因素三水平的响应面分析法对接枝溶液pH(A)、接枝反应时间(B)、阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比(C)、接枝反应温度(D)四个因素与接枝度(Y)进行响应面试验设计。试验设计如表1所示。

表1 响应面优化的因素及水平设计

1.2.6 接枝度的测定 采用OPA法[18],准确称取40 mg的OPA溶于1 mL甲醇中,分别加入20%(W/V)SDS溶液2.5 mL,0.1 mol/L硼砂溶液25 mL,β-巯基乙醇100 μL,混合均匀后用蒸馏水定容至50 mL,得到OPA试剂。每次使用前即时配制。测定时,取4 mL OPA试剂于试管中,加入200 μL样品液(5 mg/mL),混合均匀后于35 ℃水浴2 min,在340 nm处测定溶液吸光值A340,同时作空白对照。

式中:C0为原蛋白质自由氨基总量;Ct为在t时蛋白质自由氨基的含量。

1.2.7 持水性测定 根据李帅斐等[19]研究方法略有改动。准确称取m1(约为0.5 g)的蛋白样品至已知质量m2的离心管中,再加入10 mL的蒸馏水。混合均匀后在室温下静置30 min。然后在4000 r/min转速下离心10 min。弃去上清液,将沉淀和离心管一起称重,记为m3。

1.2.8 乳化性和乳化稳定性的测定 根据Kim等[20-21]研究方法略有改动。准确称取 0.25 g蛋白样品,加入0.1 mol/L pH为7.5的磷酸盐缓冲液20 mL,然后加入10 mL大豆油,在均质机中均质2 min,立即从容器底部吸取50 μL,加入7 mL 0.1%的SDS溶液,混匀后在500 nm波长处测定其吸光度值,以SDS溶液作为空白。室温放置10 min后再次从底部取样测定。

式中:DF为稀释因子,DF=101;ρ为蛋白浓度,g/mL;Φ为光程,Φ=0.01 m;θ为油相所占的分数,θ=0.25;A0为0 min时样品的吸光值;A10为10 min时样品的吸光值。

1.3 数据处理

试验中所有数据均是3次测定平均值,采用Origin 8.5版本软件进行作图和数据处理分析,采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析,采用SPSS Statistics 19.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 接枝溶液pH对接枝反应的影响 由图1可以看出,随着接枝溶液pH的增加,接枝度趋势为先上升后下降,pH为10时接枝度达到最大值(P<0.05)。在pH8～10范围内,米糠蛋白的溶解度增加,导致米糠蛋白和阿拉伯木聚糖的反应位点充分接触,接枝度随之增加。但高碱浓度会使米糠蛋白变性,同时发生米糠蛋白交联,导致接枝度下降。因此,选定pH9、10、11作为响应面设计接枝反应溶液pH的因素水平。

图1 接枝溶液pH对接枝反应的影响

2.1.2 接枝反应时间对接枝反应的影响 由图2可知,米糠蛋白接枝物的接枝度在初始阶段迅速增加,在50 min时接枝度达到最高点(P<0.05),这是因为米糠蛋白分子结构发生变化,开始解聚,分子内部的氨基与阿拉伯木聚糖结合,接枝度增加[22];随着反应持续进行,接枝度在60～80 min内维持稳定。因为伴随反应时间的加剧,蛋白水解逐渐饱和,接枝度几乎不变(P>0.05)。因此,综合各方面因素选择40、50、60 min作为响应面设计接枝反应时间的因素水平。

图2 接枝反应时间对接枝反应的影响

2.1.3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比对接枝反应的影响 从图3可以看出,阿拉伯木聚糖与米糠蛋白比值过高或过低都不利于接枝反应。当糖-蛋白质量比为2∶1时,接枝度达到最大值(P<0.05)。由此表明:在一定的糖度范围内,适当地增加糖浓度,可以增加自由氨基与糖分子羟基的碰撞结合机率,使接枝反应向正反应方向进行。但当糖溶液浓度过大时,溶液的黏性增加,流动性降低,从而使分子间的相互作用放缓,不利于接枝反应正向进行。因此,选定糖/蛋白1∶1、2∶1、3∶1作为响应面设计阿拉伯木聚糖与米糠蛋白质量比的因素水平。

图3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比对接枝反应的影响

2.1.4 接枝反应温度对接枝反应的影响 由图4可以看出,随着接枝反应温度的升高,接枝度呈现先升高后下降的趋势,在50 ℃取得峰值(P<0.05)。随着反应温度的升高,米糠蛋白结构开始疏松,米糠蛋白分子中的自由氨基含量升高,增加了自由氨基与阿拉伯木聚糖分子的羰基的反应速率,接枝度显著升高(P<0.05)。但温度过高会引发蛋白的热变性和凝聚,自由氨基含量减少,引起接枝度降低。因此,选定40、50、60 ℃作为响应面设计接枝反应温度的因素水平。

图4 接枝反应温度对接枝反应的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 方差分析及回归方程 表2展现了试验设计及结果。采用Design Expert 8.0软件对表2中的数据进行二次多项式拟合,得到接枝度的回归方程为:

表2 Box-Behnken响应面试验设计和结果

Y=33.81-0.44A-0.57B+0.12C+1.07D-2.06AB-0.72AC+1.75AD-0.69BC+0.48BD+0.31CD-2.08A2-2.66B2-0.59C2-1.41D2

表3 试验模型方差分析

2.2.2 响应曲面分析及优化 图5为各因素交互作用的响应面图,响应面越陡峭,表明各因素间交互作用越显著。不同变化趋势说明各因素之间对接枝反应的影响具有差异性。综合响应面图的陡峭程度和F值可以得出四个因素对米糠蛋白-阿拉伯木聚糖复合接枝物接枝度的影响程度为:接枝反应温度(D)>接枝反应时间(B)>pH(A)>糖-蛋白质量比(C)。根据回归方程得到接枝复合物的最佳工艺参数:接枝溶液pH10.11,接枝反应时间48.61 min,阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比2.23∶1,接枝反应温度50.47 ℃。此条件下,制备的接枝复合物接枝度为34.07%。根据实际情况,选择接枝反应溶液pH10,接枝反应时间48 min,阿拉伯木聚糖-米糠蛋白质量比2.2∶1,接枝反应温度50 ℃。在此条件下,经过三次平行实验,制备的米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝复合物接枝度为34.01%,接近最佳条件预测值。

图5 两因素的交互作用对接枝反应的影响的响应面图

2.3 接枝物的功能性质研究

2.3.1 持水性分析 由表4可知,三种样品中,米糠蛋白-阿拉伯木聚糖混合物的持水性与米糠蛋白持水性差异不大,米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物的持水性最高(P<0.05)。这可能是因为美拉德反应破坏了米糠蛋白原有的高度规则和紧密排列的蛋白质肽链,使肽链疏松不规则而使持水性增加,另一方面可能由于阿拉伯木聚糖的引入带来了亲水基团,溶液中亲水基团含量升高,持水性增加。

表4 米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物持水性分析

2.3.2 乳化性和乳化稳定性分析 如图6,米糠蛋白与阿拉伯木聚糖接枝后,在pH4～10不同条件下接枝物的乳化性都显著增加(P<0.05)。说明美拉德反应可以有效改善米糠蛋白乳化活性。这是因为通过糖基化反应引入阿拉伯木聚糖的亲水基团,促使米糠蛋白更有效地吸附在油-水界面上,界面张力的下降增加了米糠蛋白的乳化活性。并且,阿拉伯木聚糖的引入使蛋白质紧密的结构打开，变得疏松,更有利于乳化。证明糖基化反应是改善米糠蛋白乳化性的有效途径。

图6 不同pH条件下三种样品的乳化性变化

如图7,测定了pH4～10不同条件下三种样品的乳化稳定性。从图7中可以看出混合状态与米糠蛋白独自存在时均呈现先升高后下降的趋势,当pH>7时,米糠蛋白及糖蛋白混合物体系的乳化稳定性都大幅下降(P<0.05),这是由于过碱溶液使蛋白质大分子发生交联,打破了原有的水油平衡。与此对比的是,在pH>8时,糖基化后形成的接枝物的乳化稳定性维持不变(P>0.05)。体系中阿拉伯木聚糖的存在一方面增加了油-水乳化体系中水相的黏度,使乳化体系的稳定性提高。另一方面,阿拉伯木聚糖的空间位阻作用使乳化剂形成的保护膜厚度增加,维持体系乳化稳定性不变。说明糖蛋白接枝物在较宽pH范围内具有较好的乳化稳定性。

图7 不同pH条件下三种样品的乳化稳定性变化

3 结论

本实验讨论了美拉德反应改性条件对米糠蛋白糖基化接枝度的影响,通过响应面试验建立了米糠蛋白-阿拉伯木聚糖糖基化改性工艺的模型,并对此模型进行了优化,得到米糠蛋白糖基化改性的最优工艺条件为接枝反应溶液pH控制在10,接枝反应时间48 min,阿拉伯木聚糖与米糠蛋白质量比2.2∶1,接枝反应温度50 ℃,在此条件下,接枝度为34.01%。各因素对接枝反应的影响顺序为:接枝反应温度>接枝反应时间>pH>糖-蛋白质量比。经美拉德反应改性后的米糠蛋白持水性增加,乳化性和乳化稳定性明显改善,为进一步工业化生产提供依据。后续试验可针对最优工艺条件下的米糠蛋白糖基化改性产物的结构和功能性进行研究,探究米糠蛋白与阿拉伯木聚糖接枝反应的机理。